एकल अणु झल्लाहट द्वारा डीएनए पाशन पढ़ रही है
Summary
इस अध्ययन के एकल अणु प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) का उपयोग डबल असहाय डीएनए के पाशन गतिशीलता को मापने के लिए एक विस्तृत प्रायोगिक प्रक्रिया को प्रस्तुत करता है. प्रोटोकॉल भी जम्मू कारक बुलाया पाशन प्रायिकता घनत्व निकालने के लिए कैसे करें.
Abstract
डबल असहाय डीएनए (dsDNA) के झुकने ऐसे डीएनए प्रोटीन मान्यता और nucleosomes में डीएनए की पैकेजिंग के रूप में कई महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं के साथ जुड़ा हुआ है. DsDNA झुकने की ऊष्मा covalently एक dsDNA से कम चिपचिपा सिरों में शामिल होने के लिए डीएनए ligase पर निर्भर करता है जो एक विधि कहा जाता चक्रगति द्वारा अध्ययन किया गया है. हालांकि, बंधाव दक्षता डीएनए में शामिल हो गए चिपचिपा सिरों आसपास संरचना, और ligase के रूप में पाशन dsDNA से संबंधित नहीं हैं कि कई कारकों से प्रभावित किया जा सकता है भी ऐसी अविशिष्ट बंधन के रूप में तंत्र के माध्यम से स्पष्ट पाशन दर को प्रभावित कर सकते हैं. यहाँ, हम झल्लाहट (प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण) द्वारा क्षणिक डीएनए पाश गठन पता लगाने के द्वारा ligase बिना dsDNA पाशन कैनेटीक्स को मापने के लिए कैसे दिखा. dsDNA अणुओं एक झल्लाहट जोड़ी और एक बायोटिन linker के साथ एक सरल पीसीआर आधारित प्रोटोकॉल का उपयोग कर निर्माण कर रहे हैं. जम्मू कारक के रूप में जाना जाता पाशन प्रायिकता घनत्व दो disconnec के बीच पाशन दर और annealing दर से निकाला जाता हैटेड चिपचिपा समाप्त होता है. विभिन्न आंतरिक curvatures के साथ दो dsDNAs परीक्षण करके, हम जम्मू कारक dsDNA की आंतरिक आकृति के प्रति संवेदनशील है कि दिखा.
Introduction
DsDNA के यांत्रिक गुणों को समझना बुनियादी विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में बुनियादी महत्व की है. लगातार बेस जोड़े के बीच रोल, झुकाव, और मोड़ कोण दृश्य के साथ भिन्न हो सकते हैं क्योंकि dsDNA की संरचना एक सीधे पेचदार सीढ़ी से अधिक जटिल है. थर्मल उतार चढ़ाव dsDNA इस तरह, झुकने घुमा और खींच के रूप में गठनात्मक उतार चढ़ाव के विभिन्न साधनों से गुजरना करने के लिए पैदा कर सकता है. इस तरह के पिघलने और kinking के रूप में संक्रमण भी चरम स्थितियों में हो सकता है.
इन प्रस्तावों के अलावा, dsDNA झुकने सबसे महत्त्वपूर्ण जैविक प्रभाव 1 है. dsDNA झुकने एक दूसरे के करीब दो दूर के स्थानों लाकर जीन दमन या सक्रियण के साथ जुड़ा हुआ है. यह भी डीएनए सेल नाभिक के अंदर पैकेजिंग या एक वायरल capsid में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. DsDNA के झुकने विरूपण उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी (AFM 2 और मंदिर 3), और thermodyn प्रयोगात्मक द्वारा देखे जा सकते हैंamics और कैनेटीक्स रासायनिक dsDNA की Juxtaposed साइटों से लिंक जो पाशन assays, द्वारा अध्ययन किया जा सकता है.
ऐसा ही एक परख ligase निर्भर चक्रगति 4 है. इस परख में, 'चिपचिपा (एकजुट) के साथ समाप्त होता dsDNA अणुओं circularized रहे हैं या डीएनए ligase द्वारा dimerized. चक्र और डिमर गठन की दरों की तुलना करके, एक जम्मू कारक के रूप में जाना जाता है, जो दूसरे छोर के आसपास के क्षेत्र में डीएनए के एक छोर से एक प्रभावी दाढ़ एकाग्रता प्राप्त कर सकते हैं. यह जम्मू कारक दूसरे छोर से कुछ ही दूरी पर डीएनए के एक छोर पाने की संभावना घनत्व के लिए dimensionally बराबर है और इस प्रकार डीएनए के लचीलेपन को दर्शाता है. डीएनए की लंबाई के एक समारोह के रूप में जम्मू कारक मापने हठ लंबाई 4,5 सहित डीएनए यांत्रिकी के बारे में कई विशेषताओं का पता चलता है.
कीड़ा की तरह श्रृंखला (WLC) मॉडल व्यापक रूप से expla में अपनी सफलता के आधार पर dsDNA यांत्रिकी के लिए विहित बहुलक मॉडल के रूप में माना गया हैडीएनए प्रयोगों 6 खींच रहा है और सही ढंग से लंबे समय तक 200 बी पी 7 से dsDNAs की जम्मू कारकों की भविष्यवाणी में प्राप्त बल विस्तार से घटता ining. हालांकि, 100 बीपी के रूप में के रूप में कम dsDNA अणुओं पर चक्रगति परख का उपयोग, Cloutier और Widom WLC मॉडल भविष्यवाणी 8 से अधिक परिमाण के कई आदेशों होने के लिए जम्मू कारकों मापा. एक साल बाद, दू एट अल. ligase की कम सांद्रता के साथ चक्रगति परख का उपयोग WLC मॉडल के साथ समझौते में जम्मू कारकों का उत्पादन और Widom समूह से 9 इस्तेमाल किया उच्च ligase सांद्रता के लिए विषम परिणाम जिम्मेदार ठहराया. पारंपरिक परख 9 का उपयोग करते समय यह विवाद चक्रगति कैनेटीक्स पर डीएनए ligase की अपरिहार्य प्रभाव एक मिसाल है. इसके अलावा, डीएनए ligase भी अविशिष्ट बाध्यकारी 10,11 के माध्यम से डीएनए संरचना और कठोरता को प्रभावित कर सकते हैं.
प्रोटीन पर निर्भर पाशन assays के तकनीकी चिंताओं को खत्म करने के लिए हमने हाल ही में एक prot का प्रदर्शनप्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) 12 के आधार पर Ein मुक्त पाशन परख. इस विधि में, looped रचना एक डीएनए अणु का चिपचिपा सिरों के पास जुड़ी दाता और स्वीकर्ता के बीच झल्लाहट से पता चला रहे हैं. एक उद्देश्य प्रकार कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (TIRFM) प्रतिवर्ती पाशन और समय की एक लम्बी अवधि के लिए सतह से स्थिर एकल डीएनए अणु से unlooping घटनाओं के trajectories रिकॉर्ड करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस विधि Vafabakhsh और हा 13 से एक समान विधि पर एक महत्वपूर्ण सुधार है जो बेमेल मुक्त डीएनए अणु, उत्पन्न करने के लिए डीएनए अणु की पीसीआर आधारित विधानसभा सुविधाएँ. इस प्रोटोकॉल के एकल अणु पहलू झल्लाहट पहलू भी ligase गतिविधि क्षीण कर सकते हैं कि स्थितियों में, एक ही अणु से बार बार डीएनए पाशन गतिशीलता को मापने के लिए अनुमति देता है, जबकि इसके अलावा में वितरण के माप मूविंग कलाकारों की टुकड़ी को अनुमति देता है.
TIRFM सेटअप चित्र 1 में दिखाया गया है. एक कस्टमसे डिजाइन नमूना चरण एक ओलिंप IX61 माइक्रोस्कोप शरीर पर रखा गया है. 532 एनएम और 640 एनएम लेज़रों ओर से पेश कर रहे हैं और coverslip पानी इंटरफेस में घटना का महत्वपूर्ण कोण को प्राप्त करने के लिए उच्च NA उद्देश्य में छोटे अंडाकार दर्पण 14 से परिलक्षित होते हैं. हम और अधिक व्यापक dichroic दर्पण या चश्मे आधारित TIR setups का उपयोग कर के माध्यम से उद्देश्य TIR भी इस झल्लाहट आवेदन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि ध्यान दें. माइक्रोस्कोप द्वारा गठित प्रतिदीप्ति छवि एक dichroic दर्पण से दाता और स्वीकर्ता छवियों में विभाजित है. वे तो एक EMCCD के दो हिस्सों पर फिर से imaged हैं. अतिरिक्त लंबे पास उत्सर्जन फिल्टर पृष्ठभूमि संकेत को कम करने के लिए उपयोग किया जाता है.
तापमान नियंत्रण प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य गतिज डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. तापमान नियंत्रण के लिए, उद्देश्य एक तापमान नियंत्रित चिलर / हीटर से गर्मी हस्तांतरण, और पानी को कम करने के लिए माइक्रोस्कोप शरीर की nosepiece से अलग है कि कसकर फिट बैठता है एक पीतल कॉलर के माध्यम से वितरित किया जाता हैउद्देश्य जैकेट के नीचे आंतरिक धातु के आसपास. इस सेटअप 15 और 50 डिग्री सेल्सियस के बीच coverslip सतह (चित्रा 2) में मजबूत तापमान नियंत्रण हासिल करने में सक्षम है. इस काम में, नमूना तापमान 24 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया था
निम्नलिखित प्रोटोकॉल डीएनए निर्माण, डीएनए आकार के आकलन, एकल अणु प्रयोग, और जम्मू कारक निर्धारण के लिए कदम दर कदम प्रक्रिया प्रस्तुत करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
झल्लाहट पर आधारित एक सरल एकल अणु परख विभिन्न आंतरिक आकार के DNAs के पाशन कैनेटीक्स अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. घुमावदार DNAs 10.5 बीपी के पेचदार अवधि के साथ चरण में 10 पूर्व अनुक्रम दोहरा द्वारा तैय?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम समीक्षकों पांडुलिपि पढ़ने के लिए जेम्स वाटर्स, मकान का कोना वाद्स्वोर्थ और बो Broadwater धन्यवाद. हम भी उपयोगी टिप्पणी प्रदान करने के लिए चार अनाम समीक्षक धन्यवाद. हम जॉर्जिया प्रौद्योगिकी संस्थान, वैज्ञानिक इंटरफेस पर Burroughs Wellcome कोष कैरियर पुरस्कार, और जीवन प्रणालियों के NSF भौतिकी से छात्र रिसर्च नेटवर्क अनुदान से वित्तीय सहायता को स्वीकार करते हैं.
Materials
| Small DNA FRAG Extract Kit-100PR | VWR | 97060-558 | |
| Acrylamide 40% solution 500 mL | VWR | 97064-522 | |
| Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 mL | VWR | 97063-948 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1000 bp | Fermentas | SM0241 | |
| Mini Vertical PAGE System | VWR | 89032-300 | |
| Syringe filter 0.2um CS50 | VWR | A2666 | |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813-1G | triplet state quencher |
| Protocatechuic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | 08992-50MG | oxygen scavenging system |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | oxygen scavenging system |
| mPEG-silane, MW 2000 1g | Laysan Bio | MPEG-SIL-2000-1g | |
| Biotin-PEG-Silane, MW 3400 | Laysan Bio | Biotin-PEG-SIL-3400-1g | |
| Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein | Invitrogen | A2666 | |
| Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-540L | |
| Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit | IBI Scientific | IB47020 | |
| Premium plain glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| VWR micro cover glass, rectangular, no. 1 | VWR | 48404-456 | |
| Fisher Scientific Isotemp 1006s Recirculating Chiller/Heater | Fisher Scientific | temperature control | |
| Objective Cooling Collar | Bioptechs | 150303 | temperature control |
| KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage | Semprex | KMI53 | |
| High Performance DPSS Laser 532nm 50mW | Edmund optics | NT66-968 | Cy3 excitation |
| CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30mW, Fiber, FC/APC Connector | Coherent | 1139604 | Cy5 excitation |
| 650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter | Semrock | FF650-Di01-25×36 | splitting dichroic |
| LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, & 543.5 nm lasers, 25 mm | Semrock | LM01-552-25 | combining dichroic |
| Brightline Fluorescence Filter 593/40 | Semrock | FF01-593/40-25 | Cy3 emission filter |
| 635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm | Semrock | BLP01-635R-25 | Cy5 emission filter |
| EMCCD iXon+ | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| IX51 inverted microscope frame | Olympus | ||
| Objective UApo N 100x/1.49 Oil TIRF | Olympus | ||
| Immersion oil type-F for fluorescence microscopy | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| 2mm Diameter 45° Rod Lens Aluminum Coated | Edmund optics | 54-092 | miniature mirror |
| 1/4" Travel Single-Axis Translation Stage | Thorlabs | MS-1 | translation of miniature mirror |
| Ø1" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm | Thorlabs | AC254-200-A | focusing lens |
| Adjustable Mechanical Slit | Thorlabs | VA100 | |
| Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E02 | |
| Ø1" Achromatic Doublet, f = 100 mm | Thorlabs | AC254-100-A | relay lens |
| Lens Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | LMR1 | |
| Dichroic Filter Mount | Thorlabs | FFM1 | |
| Fixed Cage Cube Platform | Thorlabs | B3C | |
| Kinematic Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | KM100 | |
| N-BK7 Plano-Convex Lens, Ø1", f = 40 mm | Thorlabs | LA1422-A | collimating lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 15 mm | Thorlabs | LA1222-A | telescope lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 150 mm | Thorlabs | LA1433-A | telescope lens |
Riferimenti
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