Summary
Denne studien presenterer en detaljert eksperimentell prosedyre å måle looping dynamikken i dobbel-strandet DNA ved hjelp av single-molekyl fluorescens Resonance Energy Transfer (FRET). Protokollen beskriver også hvordan du kan hente looping sannsynlighetstetthet kalt J-faktor.
Abstract
Bøying av dobbelt-trådet DNA (dsDNA) er forbundet med mange viktige biologiske prosesser slik som DNA, protein anerkjennelse og DNA-pakking i nucleosomes. Termodynamikk av dsDNA bøying har blitt studert av en metode som kalles syklisering som er avhengig av DNA ligase å kovalent bli korte klebrige endene av en dsDNA. Imidlertid kan ligation effektivitet påvirkes av mange faktorer som ikke er relatert til dsDNA looping slik som DNA-strukturen rundt de sammenkoblede klebrige ender, og ligase kan også påvirke den tilsynelatende looping hastighet gjennom mekanismer som for eksempel ikke-spesifikk binding. Her viser vi hvordan du kan måle dsDNA looping kinetikk uten ligase ved å oppdage forbigående DNA sløyfe dannelsen av FRET (fluorescens Resonance Energy Transfer). dsDNA molekyler er bygget ved hjelp av en enkel PCR-basert protokoll med en FRET pair og en biotin linker. Looping sannsynlighetstetthet kjent som J-faktor er hentet fra looping rente og annealing hastighet mellom to utkoblingted klebrige ender. Ved å teste to dsDNAs med forskjellige iboende kurva viser vi at den J-faktoren er følsom for den iboende form av dsDNA.
Introduction
Forstå de mekaniske egenskapene til dsDNA er av fundamental betydning i grunnleggende fag og tekniske applikasjoner. Strukturen i dsDNA er mer komplisert enn en rett spiral stige fordi roll, tilt, og vri vinkler mellom påfølgende basepar kan variere med sekvens. Termiske svingninger kan føre dsDNA å gjennomgå ulike moduser av konformasjonsforandringer svingninger som bøying, vridning og stretching. Overganger som smelte og knekking kan også oppstå under ekstreme forhold.
Blant disse bevegelser, har dsDNA bøying den mest merkbare biologiske innvirkning en. dsDNA bøyning er assosiert med genet undertrykkelse eller aktivering ved å bringe to fjerntliggende steder i nærheten av hverandre. Det spiller også en viktig rolle i DNA emballasjen i cellekjernen eller et viralt kapsid. Bøying deformasjon av dsDNA kan visualiseres eksperimentelt ved høy oppløsning mikroskopi (AFM 2 og TEM 3), og THERMODYNAmics og kinetikk kan studeres ved looping analyser, som kjemisk lenker inntilliggende områder av dsDNA.
En slik analyse er ligase avhengig syklisering fire. I denne analysen blir dsDNA-molekyler med "klebrige" (kohesive) ender sirkulariserte eller dimerisert ved DNA-ligase. Ved å sammenligne ratene sirkel og dimer-dannelse, kan man oppnå en effektiv molare konsentrasjon av den ene enden av DNA i nærheten av den andre ende, som er kjent som J-faktor. Denne J-faktoren er dimensjonelt ekvivalent til sannsynlighetstettheten for å finne den ene enden av DNA ved en kort avstand fra den andre enden, og således reflekterer fleksibilitet av DNA. Måling av J-faktor som en funksjon av DNA lengde avslører mange karakteristikker om DNA mekanikk inkludert utholdenhet lengde 4,5.
Ormen-lignende kjede (WLC) modell har blitt ansett som den kanoniske polymer modell for dsDNA mekanikk basert på sin suksess i forklaringining forlengelses kraft-kurver innhentet i DNA trekke eksperimenter 6, og riktig forutsi J faktorer av dsDNAs lenger enn 200 bp 7. Men ved å bruke cykliseringen analysen på dsDNA molekyler så kort som 100 bp, Cloutier og Widom målte J faktorer å være flere størrelsesordener høyere enn WLC modell prediksjon åtte. Et år senere, Du et al. produsert J faktorer i samråd med WLC modellen ved hjelp cykliseringen analysen med lavere konsentrasjoner av ligase og tilskrives den avvikende resultat fra Widom gruppen for høye ligase konsentrasjoner brukt ni. Denne kontrovers eksemplifiserer den uunngåelige innvirkning av DNA-ligase ved syklisering kinetikken ved hjelp av konvensjonell analyse 9.. Videre kan DNA-ligase også påvirke DNA struktur og stivhet gjennom ikke-spesifikk binding 10,11.
For å eliminere de tekniske bekymringene til protein-avhengige looping analyser, vi nylig demonstrert en protEin fritt looping analysen basert på fluorescens Resonance Energy Transfer (FRET) 12. I denne metoden, blir løkker konformasjonen detektert av FRET mellom donor-og akseptor festet i nærheten av de klebrige ender av et DNA-molekyl. En objektiv-type total intern refleksjon fluorescens mikroskop (TIRFM) brukes til å registrere baner av reversibel looping og unlooping hendelser fra overflate immobilisert én DNA-molekyler for en lengre periode. Denne metoden har PCR-basert montering av DNA-molekyler for å generere feiltilpasnings-fri DNA-molekyler, noe som er en viktig forbedring i forhold til en lignende metode med Vafabakhsh og Ha 13.. Den enkelt-molekyl aspekt av denne protokollen tillater måling av fordelingene i tillegg til ensemble gjennomsnitt mens FRET aspektet gjør det mulig å måle DNA looping dynamikk flere ganger fra det samme molekylet, selv under forhold som kan svekke ligase aktivitet.
Den TIRFM oppsettet er vist i figur 1. En tilpasset-Designet prøven scenen er plassert over en Olympus IX61 mikroskop kroppen. 532 nm og 640 nm lasere er innført fra siden og blir reflektert av ørsmå elliptiske speil 14 inn i den høye NA mål å oppnå kritisk innfallsvinkel på dekkglass-vann-grenseflaten. Vi merker oss at mer utbredt gjennom-objektiv TIR hjelp dichroic speil eller prisme-baserte TIR oppsett kan også brukes til dette FRET søknad. Fluorescens bilde dannet av mikroskopet er delt i donor-og akseptor-bilder av et dikroisk speil. De blir deretter gjen avbildet på to halvdeler av en EMCCD. Andre lang-pass emisjonsfiltre blir brukt for å redusere bakgrunnssignalet.
Temperaturkontroll er viktig for å skaffe reproduserbare kinetiske data. For temperaturkontroll er det formål skilt fra munnstykket av mikroskopet organ for å minimere varmeoverføring, og vann fra et temperaturkontrollert kjøle / varmeapparat blir sirkulert gjennom en messingkrage som er tett passerrundt den indre metall under objektivet jakke. Denne konfigurasjonen er i stand til å oppnå robust temperaturkontroll på dekkflaten mellom 15 og 50 ° C (figur 2). I dette arbeidet ble prøven temperaturen holdes på 24 ° C.
Følgende protokoll presenterer trinn-for-trinn prosedyre for DNA konstruksjon, estimering av DNA form, single-molekyl eksperiment, og J-faktor besluttsomhet.
Protocol
Representative Results
Discussion
En enkel enkelt-molekylet assay basert på FRET ble brukt til å studere kinetikken for looping DNA'er av forskjellige iboende former. Sving DNA-molekyler, kan fremstilles ved å gjenta en 10-mer-sekvens i fase med det skruelinjeformede periode på 10,5 bp, og deres krumninger kan estimeres ved hjelp av PAGE. Disse dsDNAs er utformet med klebrige endene til å tillate forbigående sløyfe stabilisering. Vi pakket ut looping sats fra den eksponentielle økningen i antall løkker molekyler over tid. Den annealing hast…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker James Waters, Gable Wadsworth og Bo Broad for kritisk lesing av manuskriptet. Vi takker også fire anonyme anmeldere for å gi nyttige kommentarer. Vi erkjenner økonomisk støtte fra Georgia Institute of Technology, Burroughs Wellcome Fund Career Award på Scientific Interface, og studenten forskningsnettverket stipend fra NSF Physics of Living Systems.
Materials
| Small DNA FRAG Extract Kit-100PR | VWR | 97060-558 | |
| Acrylamide 40% solution 500 mL | VWR | 97064-522 | |
| Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 mL | VWR | 97063-948 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1000 bp | Fermentas | SM0241 | |
| Mini Vertical PAGE System | VWR | 89032-300 | |
| Syringe filter 0.2um CS50 | VWR | A2666 | |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813-1G | triplet state quencher |
| Protocatechuic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | 08992-50MG | oxygen scavenging system |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | oxygen scavenging system |
| mPEG-silane, MW 2000 1g | Laysan Bio | MPEG-SIL-2000-1g | |
| Biotin-PEG-Silane, MW 3400 | Laysan Bio | Biotin-PEG-SIL-3400-1g | |
| Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein | Invitrogen | A2666 | |
| Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-540L | |
| Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit | IBI Scientific | IB47020 | |
| Premium plain glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| VWR micro cover glass, rectangular, no. 1 | VWR | 48404-456 | |
| Fisher Scientific Isotemp 1006s Recirculating Chiller/Heater | Fisher Scientific | temperature control | |
| Objective Cooling Collar | Bioptechs | 150303 | temperature control |
| KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage | Semprex | KMI53 | |
| High Performance DPSS Laser 532nm 50mW | Edmund optics | NT66-968 | Cy3 excitation |
| CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30mW, Fiber, FC/APC Connector | Coherent | 1139604 | Cy5 excitation |
| 650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter | Semrock | FF650-Di01-25×36 | splitting dichroic |
| LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, & 543.5 nm lasers, 25 mm | Semrock | LM01-552-25 | combining dichroic |
| Brightline Fluorescence Filter 593/40 | Semrock | FF01-593/40-25 | Cy3 emission filter |
| 635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm | Semrock | BLP01-635R-25 | Cy5 emission filter |
| EMCCD iXon+ | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| IX51 inverted microscope frame | Olympus | ||
| Objective UApo N 100x/1.49 Oil TIRF | Olympus | ||
| Immersion oil type-F for fluorescence microscopy | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| 2mm Diameter 45° Rod Lens Aluminum Coated | Edmund optics | 54-092 | miniature mirror |
| 1/4" Travel Single-Axis Translation Stage | Thorlabs | MS-1 | translation of miniature mirror |
| Ø1" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm | Thorlabs | AC254-200-A | focusing lens |
| Adjustable Mechanical Slit | Thorlabs | VA100 | |
| Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E02 | |
| Ø1" Achromatic Doublet, f = 100 mm | Thorlabs | AC254-100-A | relay lens |
| Lens Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | LMR1 | |
| Dichroic Filter Mount | Thorlabs | FFM1 | |
| Fixed Cage Cube Platform | Thorlabs | B3C | |
| Kinematic Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | KM100 | |
| N-BK7 Plano-Convex Lens, Ø1", f = 40 mm | Thorlabs | LA1422-A | collimating lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 15 mm | Thorlabs | LA1222-A | telescope lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 150 mm | Thorlabs | LA1433-A | telescope lens |
Riferimenti
- Garcia, H. G., et al. Biological consequences of tightly bent DNA: The other life of a macromolecular celebrity. Biopolymers. 85, 115-130 (2007).
- Wiggins, P. A., et al. High flexibility of DNA on short length scales probed by atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 1, (2006).
- Lionberger, T. A., et al. Cooperative kinking at distant sites in mechanically stressed DNA. Nucleic Acids Research. 41, 6785-6792 (2011).
- Shore, D., et al. DNA flexibility studied by covalent closure of short fragments into circles. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 4833-4837 (1981).
- Geggier, S., Vologodskii, A. Sequence dependence of DNA bending rigidity. Proc Nat Acad Sci U S A. 107, 15421-15426 (1992).
- Smith, S. B., et al. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Peters, J. P., Maher, L. J. DNA curvature and flexibility in vitro and in vivo. Quarterly Reviews of Biophysics. 43, 23-63 (2010).
- Cloutier, T. E., Widom, J. Spontaneous sharp bending of double-stranded DNA. Molecular Cell. 14, 355-362 (2004).
- Du, Q., et al. Cyclization of short DNA fragments and bending fluctuations of the double helix. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 5397-5402 (2005).
- Yuan, C., et al. T4 DNA ligase is more than an effective trap of cyclized dsDNA. Nucl. Acids Res. 35, 5294-5302 (2007).
- Manzo, C., et al. The effect of nonspecific binding of lambda repressor on DNA looping dynamics. Biophysical Journal. 103, 1753-1761 (2012).
- Le, T. T., Kim, H. D. Measuring shape-dependent looping probability of DNA. Biophys. J. 104, 2068-2076 (2013).
- Vafabakhsh, R., Ha, T. Extreme bendability of DNA less than 100 base pairs long revealed by single-molecule cyclization. Science. 337, 1097-1101 (2012).
- Friedman, L., et al. Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence. Biophysical Journal. 91, 1023-1031 (2006).
- Kaplan, N., et al. The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome. Nature. 458, 362-366 (2009).
- Koo, H. S., Crothers, D. M. Calibration of DNA curvature and a unified description of sequence-directed bending. Proc Nat Acad Sci U S A. 85, 1763-1767 (1988).
- Prosseda, G., et al. A temperature-induced narrow DNA curvature range sustains the maximum activity of a bacterial promoter in vitro. Biochimica. 49, 2778-2785 (2010).
- Rasnik, I., et al. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3, 891-893 (2006).
- Cordes, T., et al. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. J. Am. Chem. Soc. 131, 5018-5019 (2009).
- Aitken, C. E., et al. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
- Taylor, W. H., Hagerman, P. J. Application of the method of phage T4 DNA ligase-catalyzed ring-closure to the study of DNA structure: II. NaCl-dependence of DNA flexibility and helical repeat. Journal of Molecular Biology. 212, 363-376 (1990).
- Bolshoy, A., et al. Curved DNA without A-A: experimental estimation of all 16 DNA wedge angles. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 2312-2316 (1991).
- Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucl. Acids Res. 37, 6984-6990 (2009).
- Vologodskii, A., et al. Bending of short DNA helices. Artif DNA PNA XNA. 4, (2013).
- Hoover, D. M., Lubkowski, J. DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis. Nucl. Acids Res. 30, (2002).
- Waters, J. T., Kim, H. D. Equilibrium Statistics of a Surface-Pinned Semiflexible Polymer. Macromolecules. 46, 6659-6666 (2013).
- Mills, J. B., et al. Electrophoretic evidence that single-stranded regions of 1 or more nucleotides dramatically increase the flexibility of DNA. Biochimica. 33, 1797-1803 (1994).
