El estudio de ADN Looping por FRET sola molécula
Summary
Este estudio presenta un procedimiento experimental detallado para medir la dinámica de bucle de ADN de doble cadena utilizando una sola molécula de transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET). El protocolo también se describe cómo extraer la densidad de probabilidad de bucle llamado factor J.
Abstract
De flexión de ADN de doble cadena (dsDNA) se asocia con muchos procesos biológicos importantes, tales como el reconocimiento de DNA-proteína y el empaquetamiento del ADN en nucleosomas. Termodinámica de ADN de doble cadena de flexión se ha estudiado mediante un método denominado ciclación que se basa en la ADN ligasa para unir covalentemente los extremos pegajosos cortos de un ADN de doble cadena. Sin embargo, la eficiencia de la ligadura puede verse afectada por muchos factores que no están relacionados con dsDNA bucle tales como la estructura del ADN que rodea los extremos pegajosos unidas, y ligasa también puede afectar a la velocidad de bucle evidente a través de mecanismos tales como la unión no específica. Aquí, se muestra la forma de medir la cinética de bucle de ADN bicatenario sin ligasa mediante la detección de la formación de bucle de ADN transitoria por FRET (transferencia de energía de resonancia fluorescente). moléculas de ADN de doble cadena se construyen usando un simple protocolo basado en PCR con un par de FRET y un enlazador biotina. La densidad de probabilidad de bucle conocido como el factor de J se extrae de la tasa de bucle y la tasa de recocido entre dos desconexiónted extremos pegajosos. Al poner a prueba dos dsDNAs con diferentes curvaturas intrínsecas, se muestra que el factor J es sensible a la forma intrínseca de la ADN de doble cadena.
Introduction
La comprensión de las propiedades mecánicas de ADN de doble cadena es de importancia fundamental en las ciencias básicas y aplicaciones de ingeniería. La estructura de ADN de doble cadena es más complicado que una escalera helicoidal recto debido ángulos de balanceo, inclinación y giro entre pares de bases sucesivas pueden variar con la secuencia. Fluctuaciones térmicas pueden provocar dsDNA a someterse a diversos modos de fluctuaciones conformacionales como la flexión, torsión y estiramiento. Transiciones de fusión tales como el retorcimiento y también pueden ocurrir en condiciones extremas.
Entre estos movimientos, dsDNA flexión tiene el impacto biológico más sensible 1. ADN de doble cadena de flexión está asociada con la represión de genes o la activación por la unión de dos sitios distantes cerca uno del otro. También juega un papel importante en el empaquetamiento del ADN dentro del núcleo de la célula o de una cápside viral. Deformación por flexión de ADN de doble cadena se puede visualizar experimentalmente por microscopía de alta resolución (AFM 2 y TEM 3), y la Thermodynamics y cinéticas pueden ser estudiadas mediante ensayos de bucle, que enlazan químicamente sitios yuxtapuestos del ADN de doble cadena.
Uno de tales ensayos es ligasa dependiente de ciclación 4. En este ensayo, las moléculas de ADN de doble cadena con extremos 'pegajosos' (cohesivos) se circularized o dimerizados por ADN ligasa. Mediante la comparación de las tasas de círculo y la formación de dímero, se puede obtener una concentración molar eficaz de uno de los extremos del ADN en la proximidad del otro extremo, que se conoce como el factor de J. Este factor J es dimensionalmente equivalente a la densidad de probabilidad de encontrar un extremo del ADN a una distancia corta desde el otro extremo, y por lo tanto refleja la flexibilidad del ADN. Medir el factor de J como una función de la longitud del ADN revela muchas características acerca de la mecánica de ADN incluyendo el 4,5 longitud de persistencia.
La cadena de gusano-como modelo (WLC) ha sido ampliamente considerado como el modelo canónico de polímero para la mecánica dsDNA en función de su éxito en la explicaciónnando las curvas fuerza-extensión obtenidos en el ADN tirando experimentos 6 y predecir correctamente los factores de J dsDNAs más de 200 pb 7. Sin embargo, usando el ensayo de ciclación en las moléculas de ADN de doble cadena tan cortos como 100 pb, Cloutier y Widom midieron los factores J ser varios órdenes de magnitud mayor que la predicción del modelo WLC 8. Un año más tarde, Du et al. producido J factores de acuerdo con el modelo WLC usando el ensayo de ciclación con concentraciones más bajas de ligasa y atribuido el resultado anómalo del grupo Widom a concentraciones altas ligasa utilizada 9. Esta controversia es un ejemplo de la influencia inevitable de la ADN ligasa en la cinética de ciclación cuando se utiliza el ensayo convencional 9. Por otra parte, la ligasa de ADN también puede afectar a la estructura del ADN y la rigidez a través inespecífica 10,11 vinculante.
Para eliminar los problemas técnicos de los ensayos de bucles de proteínas dependientes, hemos demostrado una protensayo de bucle ein-gratuito basado en energía de resonancia fluorescente Transfer (FRET) 12. En este método, las conformaciones en bucle se detectan por FRET entre el donante y aceptor unido cerca de los extremos pegajosos de una molécula de ADN. Un microscopio de fluorescencia de reflexión total interna de tipo objetivo (TIRFM) se utiliza para registrar las trayectorias de bucle reversible y eventos unlooping de moléculas individuales de ADN inmovilizado en la superficie por un período de tiempo prolongado. Este método cuenta con el montaje basado en la PCR de moléculas de ADN para generar moléculas de ADN-desajuste libre, que es una mejora crucial en un método similar por Vafabakhsh y Ha 13. El aspecto de una sola molécula de este protocolo permite la medición de distribuciones en adición a Ensemble promedios mientras que el aspecto de FRET permite medir la dinámica de bucle de ADN repetidamente de la misma molécula, incluso en condiciones que pueden afectar la actividad ligasa.
La configuración TIRFM se muestra en la Figura 1. Una costumbrePlatina de diseño se coloca sobre un cuerpo del microscopio Olympus IX61. 532 nm y 640 nm láser se introducen desde el lado y son reflejados por espejos diminutos elípticas 14 en el alta NA objetivo de lograr ángulo crítico de incidencia en la interfaz agua-cubreobjetos. Observamos que más generalizada-a través de objetivo TIR utilizando espejos dicroicos o configuraciones de TIR a base de prisma también se puede utilizar para esta aplicación de FRET. La imagen de fluorescencia formado por el microscopio se divide en donante y aceptor de imágenes por un espejo dicroico. Ellos se vuelven a reflejados en dos mitades de una EMCCD. Filtros de emisión de paso de largo adicionales se utilizan para reducir la señal de fondo.
El control de temperatura es esencial para la adquisición de los datos cinéticos reproducibles. Para el control de la temperatura, el objetivo se separa de la pieza de nariz del cuerpo del microscopio para minimizar la transferencia de calor, y el agua de un enfriador controlada / calentador de la temperatura se hace circular a través de un collar de latón que encaja herméticamentealrededor del metal interior debajo de la chaqueta objetivo. Esta configuración es capaz de alcanzar control de la temperatura robusta en la superficie cubreobjetos entre 15 y 50 ° C (Figura 2). En este trabajo, la temperatura de la muestra se mantuvo a 24 ° C.
El protocolo siguiente se presenta el procedimiento paso a paso para la construcción de ADN, la estimación de la forma de ADN, el experimento de una sola molécula, y la determinación del factor J.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se utilizó un ensayo simple de una sola molécula basado en FRET para estudiar la cinética de bucle de ADN de diferentes formas intrínsecas. ADNs curvados se pueden preparar mediante la repetición de una secuencia de 10-mer, en fase con el período helicoidal de 10,5 pb, y sus curvaturas pueden ser estimados utilizando la página. Estos dsDNAs están diseñados con extremos pegajosos para permitir la estabilización transitoria de bucle. Se extrajo la tasa de bucle desde el aumento exponencial en el número de molé…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a James Waters, Gable Wadsworth y Bo Broadwater para la lectura crítica del manuscrito. También agradecemos a cuatro revisores anónimos por proporcionar comentarios útiles. Reconocemos el apoyo financiero del Instituto de Tecnología de Georgia, el premio a la Trayectoria Fondo Burroughs Wellcome en la interfaz de la Ciencia y la concesión de la red de investigación de estudiantes de la NSF Física de Sistemas Vivos.
Materials
| Small DNA FRAG Extract Kit-100PR | VWR | 97060-558 | |
| Acrylamide 40% solution 500 mL | VWR | 97064-522 | |
| Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 mL | VWR | 97063-948 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1000 bp | Fermentas | SM0241 | |
| Mini Vertical PAGE System | VWR | 89032-300 | |
| Syringe filter 0.2um CS50 | VWR | A2666 | |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813-1G | triplet state quencher |
| Protocatechuic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | 08992-50MG | oxygen scavenging system |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | oxygen scavenging system |
| mPEG-silane, MW 2000 1g | Laysan Bio | MPEG-SIL-2000-1g | |
| Biotin-PEG-Silane, MW 3400 | Laysan Bio | Biotin-PEG-SIL-3400-1g | |
| Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein | Invitrogen | A2666 | |
| Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-540L | |
| Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit | IBI Scientific | IB47020 | |
| Premium plain glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| VWR micro cover glass, rectangular, no. 1 | VWR | 48404-456 | |
| Fisher Scientific Isotemp 1006s Recirculating Chiller/Heater | Fisher Scientific | temperature control | |
| Objective Cooling Collar | Bioptechs | 150303 | temperature control |
| KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage | Semprex | KMI53 | |
| High Performance DPSS Laser 532nm 50mW | Edmund optics | NT66-968 | Cy3 excitation |
| CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30mW, Fiber, FC/APC Connector | Coherent | 1139604 | Cy5 excitation |
| 650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter | Semrock | FF650-Di01-25×36 | splitting dichroic |
| LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, & 543.5 nm lasers, 25 mm | Semrock | LM01-552-25 | combining dichroic |
| Brightline Fluorescence Filter 593/40 | Semrock | FF01-593/40-25 | Cy3 emission filter |
| 635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm | Semrock | BLP01-635R-25 | Cy5 emission filter |
| EMCCD iXon+ | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| IX51 inverted microscope frame | Olympus | ||
| Objective UApo N 100x/1.49 Oil TIRF | Olympus | ||
| Immersion oil type-F for fluorescence microscopy | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| 2mm Diameter 45° Rod Lens Aluminum Coated | Edmund optics | 54-092 | miniature mirror |
| 1/4" Travel Single-Axis Translation Stage | Thorlabs | MS-1 | translation of miniature mirror |
| Ø1" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm | Thorlabs | AC254-200-A | focusing lens |
| Adjustable Mechanical Slit | Thorlabs | VA100 | |
| Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E02 | |
| Ø1" Achromatic Doublet, f = 100 mm | Thorlabs | AC254-100-A | relay lens |
| Lens Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | LMR1 | |
| Dichroic Filter Mount | Thorlabs | FFM1 | |
| Fixed Cage Cube Platform | Thorlabs | B3C | |
| Kinematic Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | KM100 | |
| N-BK7 Plano-Convex Lens, Ø1", f = 40 mm | Thorlabs | LA1422-A | collimating lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 15 mm | Thorlabs | LA1222-A | telescope lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 150 mm | Thorlabs | LA1433-A | telescope lens |
Riferimenti
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