Tek Molekül FRET DNA döngü oluşturma incelenmesi
Summary
Bu çalışma, tek bir molekül flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) kullanılarak çift sarmallı DNA ilmek dinamiklerini ölçmek için bir ayrıntılı deneysel prosedür sunmaktadır. Protokol ayrıca J faktörü denilen döngü olasılık yoğunluğunu ayıklamak için nasıl açıklar.
Abstract
Iki-şeritli DNA (dsDNA) eğilmesi gibi DNA-protein tanıma ve nükleozom içine DNA paket gibi birçok önemli biyolojik süreçler ile ilişkilidir. DsDNA bükme Termodinamik kovalent bir dsDNA'nın kısa yapışkan uçlarını birleştiren DNA ligaz dayanan bir yöntem denilen siklizasyonu tarafından incelenmiştir. Bununla birlikte, bu gibi bağlama verimliliği DNA katılan yapışkan uçlarını çevreleyen yapı ve ligaz gibi döngü dsDNA ile ilişkili olmayan bir çok faktör tarafından etkilenebilir, aynı zamanda, non-spesifik bağlanma gibi mekanizmalar yoluyla belirgin ilmek hızını etkileyebilir. Burada, biz FRET (Floresan Rezonans Enerji Transferi) tarafından geçici DNA döngü oluşumunu tespit ederek ligazın olmadan dsDNA ilmek kinetik ölçmek için nasıl göstereceğim. dsDNA molekülleri, FRET çifti ve bir biyotin bağlayıcı ile basit PCR tabanlı bir protokol kullanılarak inşa edilmektedir. J faktörü olarak bilinen döngü olasılık yoğunluk kapa iki döngü arasındaki oran ile tavlama oranı elde edilirted yapışkan biter. Farklı içsel eğriliğe sahip iki dsDNAs test ederek, J faktör dsDNA iç şekline duyarlı olduğunu göstermektedir.
Introduction
DsDNA'nın mekanik özelliklerini anlama, temel bilimler ve mühendislik uygulamalarında temel bir öneme sahiptir. Ardışık baz çiftleri arasına rulo, eğim ve büküm açıları dizisi ile değişebilir çünkü dsDNA'nın yapısı düz bir sarmal merdiven daha karmaşıktır. Termal dalgalanmalar dsDNA gibi, bükme büküm ve germe gibi yapısal dalgalanmalara farklı modları geçmesi neden olabilir. Bu eritme ve dolanmaya olarak geçişleri de aşırı koşullarda oluşabilir.
Bu hareketler arasında, dsDNA bükme en çok dikkat çeken biyolojik etkiye sahiptir 1. dsDNA eğilme birbirine yakın iki uzak siteleri getirerek gen baskıyla veya aktivasyonu ile ilişkilidir. Ayrıca, DNA hücre çekirdeğinin içine ambalaj veya bir viral kapsid önemli bir rol oynar. DsDNA bükülmesi deformasyonu yüksek çözünürlüklü mikroskopisi (AFM 2 ve 3 TEM) ve Thermodyn ile deneysel olarak görselleştirilebiliramics ve kinetik kimyasal dsDNA'nın yan yana sitelere link loop tahliller ile ele alınabilir.
Böyle bir deney, ligaz bağımlı siklizasyon 4'tür. Bu testte, 'yapışkan' (yapışkan) uçları ile dsDNA moleküller sirküle veya DNA ligazı ile dimerize. Daire ve dimer oluşumunun oranlarını karşılaştırarak, bir J faktör olarak bilinen diğer ucu, yakın DNA'nın bir ucunun etkin bir molar konsantrasyon elde edebilir. Bu, J faktör diğer ucunda, kısa bir mesafede, DNA'nın bir ucu bulma olasılığı yoğunluğuna boyutlu eşdeğerdir ve bu şekilde DNA'nın bir esneklik göstermektedir. DNA uzunluğunun bir fonksiyonu olarak J faktörünün ölçülmesi kalıcı uzunluğu 4,5 'da dahil olmak üzere bir DNA ile ilgili birçok mekanik özelliklerini ortaya koymaktadır.
Solucan benzeri zincir (WLC) modeli yaygın bir açıklamaya onun başarısına dayanan dsDNA mekaniği için kanonik polimer modeli olarak kabul edilmiştirDNA deneyleri 6 çekerek, doğru ve uzun 200 bp 7 daha dsDNAs arasında J faktörleri tahmin elde kuvvet-uzatma eğrileri adencilik. Bununla birlikte, 100 bp kadar kısa dsDNA moleküller üzerinde siklizasyon deneyi kullanılarak, Cloutier ve Widom WLC modeli tahmin 8 daha yüksek, birkaç kat olmak J faktörleri ölçülür. Bir yıl sonra, Du ve ark. ligazı düşük konsantrasyonları ile siklizasyon deneyi kullanılarak WLC modeli ile uyum içinde J faktörleri üretilen ve Widom gruptan 9 ligaz kullanılan yüksek konsantrasyonlara anormal sonucu bağlanabilir. Geleneksel tahlil 9 kullanırken bu tartışma siklizasyonudur kinetik DNA ligaz kaçınılmaz etkisini örneğidir. Ayrıca, DNA ligaz, aynı zamanda non-spesifik bağlanma 10,11 aracılığıyla gerçekleştirilen DNA yapısı ve sertlik etkileyebilir.
Protein-bağımlı ilmek testlerin teknik endişelerini ortadan kaldırmak için, son zamanlarda bir prot gösterdiFlüoresans Rezonans Enerji Transferi (FRET) 12 göre ein içermeyen döngü deneyi. Bu yöntemde, döngüye konformasyonları bir DNA molekülünün yapışkan uçlarının yakınında bağlı verici ve alıcı arasında FRET ile tespit edilir. Objektif tipi toplam iç yansıma flüoresans mikroskobu (TIRFM) geri loop ve uzun bir süre için hareketsiz kılınmış yüzeye tek bir DNA moleküllerinden unlooping etkinlikleri yörüngeleri kaydetmek için kullanılır. Bu yöntem, Vafabakhsh Ha ve 13 ile benzer bir yöntem üzerinde çok önemli bir gelişmedir uyumsuzluk içermeyen DNA molekülleri oluşturmak için DNA moleküllerinin PCR tabanlı bir montaj sağlar. Bu protokol, tek moleküllü bir yönü, FRET yönü bir hatta ligaz aktivitesi bozabilir koşullarda, aynı molekülde tekrar tekrar DNA ilmek dinamikleri ölçmek için sağlar Buna ek olarak dağılımlarının ölçüm ortalamalar topluluğa sağlar.
TIRFM düzeneği Şekil 1'de gösterilmiştir. Özel bir-Tasarlanmış numune aşama bir Olympus IX61 mikroskop vücuda yerleştirilir. 532 nm ve 640 nm lazerler tarafından tanıtıldı ve lamel-su arayüzünde geliş kritik açıyı elde etmek için yüksek NA objektif içine küçük eliptik ayna 14 tarafından yansıtılır. Daha yaygın bir dikroik ayna veya prizma bazlı TIR kurulumları kullanılarak objektif TIR da FRET, bu uygulama için kullanılabilir unutmayın. Mikroskop ile oluşan floresan görüntü bir dikroik ayna, verici ve alıcı görüntüleri ayrılmıştır. Daha sonra, bir EMCCD iki yarısı üzerine yeniden görüntülü. Ek uzun geçiş filtresi emisyon arka plan sinyali azaltmak için kullanılır.
Sıcaklık kontrolü tekrarlanabilir kinetik verileri elde etmek için gereklidir. Sıcaklık kontrolü için, objektif, sıcaklık kontrollü bir soğutucu / ısıtıcı ısı transferi, ve su en aza indirmek için mikroskop vücudun burun parçası ayrılır sıkıca oturan bir pirinç bileziği yoluyla sirküle ediliramaç kılıfın altında iç metal etrafında. Bu kurulum 15 ve 50 ° C arasında lamel yüzey (Şekil 2) sağlam sıcaklık kontrolünü sağlamak mümkün. Bu çalışmada, örnek sıcaklığı 24 ° C'de muhafaza edilmiştir
Aşağıdaki protokol DNA yapımında, DNA şekil tahmini, tek molekül deney ve J faktör belirlenmesi için adım adım işlemi sunar.
Protocol
Representative Results
Discussion
FRET göre basit bir tek-molekül deney farklı şekillerde iç DNA'ların ilmek kinetiğini incelemek için kullanılmıştır. Eğimli DNA'lar 10.5 bp'lik sarmal süresi ile aynı fazda bir 10-mer dizisini tekrar ile hazırlanabilir, ve eğrilikleri PAGE kullanılarak tahmin edilebilir. Bu dsDNAs geçici döngü stabilizasyonu sağlamak için yapışkan uçları ile tasarlanmıştır. Zamanla döngüye moleküllerin sayısındaki artıştan üstel döngü hızı ekstre edilmiştir. Kesilmiş yapışkan uç…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz eleştirel yazının okunması için James Waters, Gable Wadsworth'u ve Bo Broadwater teşekkür ederim. Biz de yararlı yorumlar sağlamak için dört anonim yorumcular teşekkür ederim. Biz Georgia Teknoloji Enstitüsü, Bilimsel Arakesitte Burroughs Wellcome Fonu Kariyer Ödülü ve Yaşam Sistemleri NSF Fizik gelen öğrenci araştırma ağı hibe mali destek kabul.
Materials
| Small DNA FRAG Extract Kit-100PR | VWR | 97060-558 | |
| Acrylamide 40% solution 500 mL | VWR | 97064-522 | |
| Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 mL | VWR | 97063-948 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1000 bp | Fermentas | SM0241 | |
| Mini Vertical PAGE System | VWR | 89032-300 | |
| Syringe filter 0.2um CS50 | VWR | A2666 | |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813-1G | triplet state quencher |
| Protocatechuic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | 08992-50MG | oxygen scavenging system |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | oxygen scavenging system |
| mPEG-silane, MW 2000 1g | Laysan Bio | MPEG-SIL-2000-1g | |
| Biotin-PEG-Silane, MW 3400 | Laysan Bio | Biotin-PEG-SIL-3400-1g | |
| Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein | Invitrogen | A2666 | |
| Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-540L | |
| Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit | IBI Scientific | IB47020 | |
| Premium plain glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| VWR micro cover glass, rectangular, no. 1 | VWR | 48404-456 | |
| Fisher Scientific Isotemp 1006s Recirculating Chiller/Heater | Fisher Scientific | temperature control | |
| Objective Cooling Collar | Bioptechs | 150303 | temperature control |
| KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage | Semprex | KMI53 | |
| High Performance DPSS Laser 532nm 50mW | Edmund optics | NT66-968 | Cy3 excitation |
| CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30mW, Fiber, FC/APC Connector | Coherent | 1139604 | Cy5 excitation |
| 650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter | Semrock | FF650-Di01-25×36 | splitting dichroic |
| LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, & 543.5 nm lasers, 25 mm | Semrock | LM01-552-25 | combining dichroic |
| Brightline Fluorescence Filter 593/40 | Semrock | FF01-593/40-25 | Cy3 emission filter |
| 635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm | Semrock | BLP01-635R-25 | Cy5 emission filter |
| EMCCD iXon+ | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| IX51 inverted microscope frame | Olympus | ||
| Objective UApo N 100x/1.49 Oil TIRF | Olympus | ||
| Immersion oil type-F for fluorescence microscopy | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| 2mm Diameter 45° Rod Lens Aluminum Coated | Edmund optics | 54-092 | miniature mirror |
| 1/4" Travel Single-Axis Translation Stage | Thorlabs | MS-1 | translation of miniature mirror |
| Ø1" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm | Thorlabs | AC254-200-A | focusing lens |
| Adjustable Mechanical Slit | Thorlabs | VA100 | |
| Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E02 | |
| Ø1" Achromatic Doublet, f = 100 mm | Thorlabs | AC254-100-A | relay lens |
| Lens Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | LMR1 | |
| Dichroic Filter Mount | Thorlabs | FFM1 | |
| Fixed Cage Cube Platform | Thorlabs | B3C | |
| Kinematic Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | KM100 | |
| N-BK7 Plano-Convex Lens, Ø1", f = 40 mm | Thorlabs | LA1422-A | collimating lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 15 mm | Thorlabs | LA1222-A | telescope lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 150 mm | Thorlabs | LA1433-A | telescope lens |
Riferimenti
- Garcia, H. G., et al. Biological consequences of tightly bent DNA: The other life of a macromolecular celebrity. Biopolymers. 85, 115-130 (2007).
- Wiggins, P. A., et al. High flexibility of DNA on short length scales probed by atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 1, (2006).
- Lionberger, T. A., et al. Cooperative kinking at distant sites in mechanically stressed DNA. Nucleic Acids Research. 41, 6785-6792 (2011).
- Shore, D., et al. DNA flexibility studied by covalent closure of short fragments into circles. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 4833-4837 (1981).
- Geggier, S., Vologodskii, A. Sequence dependence of DNA bending rigidity. Proc Nat Acad Sci U S A. 107, 15421-15426 (1992).
- Smith, S. B., et al. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Peters, J. P., Maher, L. J. DNA curvature and flexibility in vitro and in vivo. Quarterly Reviews of Biophysics. 43, 23-63 (2010).
- Cloutier, T. E., Widom, J. Spontaneous sharp bending of double-stranded DNA. Molecular Cell. 14, 355-362 (2004).
- Du, Q., et al. Cyclization of short DNA fragments and bending fluctuations of the double helix. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 5397-5402 (2005).
- Yuan, C., et al. T4 DNA ligase is more than an effective trap of cyclized dsDNA. Nucl. Acids Res. 35, 5294-5302 (2007).
- Manzo, C., et al. The effect of nonspecific binding of lambda repressor on DNA looping dynamics. Biophysical Journal. 103, 1753-1761 (2012).
- Le, T. T., Kim, H. D. Measuring shape-dependent looping probability of DNA. Biophys. J. 104, 2068-2076 (2013).
- Vafabakhsh, R., Ha, T. Extreme bendability of DNA less than 100 base pairs long revealed by single-molecule cyclization. Science. 337, 1097-1101 (2012).
- Friedman, L., et al. Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence. Biophysical Journal. 91, 1023-1031 (2006).
- Kaplan, N., et al. The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome. Nature. 458, 362-366 (2009).
- Koo, H. S., Crothers, D. M. Calibration of DNA curvature and a unified description of sequence-directed bending. Proc Nat Acad Sci U S A. 85, 1763-1767 (1988).
- Prosseda, G., et al. A temperature-induced narrow DNA curvature range sustains the maximum activity of a bacterial promoter in vitro. Biochimica. 49, 2778-2785 (2010).
- Rasnik, I., et al. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3, 891-893 (2006).
- Cordes, T., et al. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. J. Am. Chem. Soc. 131, 5018-5019 (2009).
- Aitken, C. E., et al. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
- Taylor, W. H., Hagerman, P. J. Application of the method of phage T4 DNA ligase-catalyzed ring-closure to the study of DNA structure: II. NaCl-dependence of DNA flexibility and helical repeat. Journal of Molecular Biology. 212, 363-376 (1990).
- Bolshoy, A., et al. Curved DNA without A-A: experimental estimation of all 16 DNA wedge angles. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 2312-2316 (1991).
- Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucl. Acids Res. 37, 6984-6990 (2009).
- Vologodskii, A., et al. Bending of short DNA helices. Artif DNA PNA XNA. 4, (2013).
- Hoover, D. M., Lubkowski, J. DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis. Nucl. Acids Res. 30, (2002).
- Waters, J. T., Kim, H. D. Equilibrium Statistics of a Surface-Pinned Semiflexible Polymer. Macromolecules. 46, 6659-6666 (2013).
- Mills, J. B., et al. Electrophoretic evidence that single-stranded regions of 1 or more nucleotides dramatically increase the flexibility of DNA. Biochimica. 33, 1797-1803 (1994).
