L'infezione umana da Entamoeba histolytica porta ad amebiasi, una delle principali cause di diarrea nei paesi tropicali. L'infezione è avviata da patogeno con cellule epiteliali intestinali, provocando l'apertura dei contatti cellula-cellula e di conseguenza diarrea, a volte seguita da infezione fegato. Questo articolo fornisce un modello per valutare le interazioni primi ospite-patogeno per migliorare la nostra comprensione della patogenesi amebiasi.
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Articolo metodologico
Analisi del danno epiteliale Prodotto da
In questo articolo
Sommario
Abstract
Entamoeba histolytica è l'agente eziologico di amebiasi umana, una delle principali cause di diarrea e di ascesso epatico nei paesi tropicali. L'infezione è avviata da interazione del patogeno con le cellule epiteliali intestinali. Questa interazione porta alla rottura delle strutture intercellulari come giunzioni strette (TJ). TJ assicurare la chiusura dello strato epiteliale per separare tessuto ospite dal lume intestinale. Recenti studi forniscono prove che la rottura del TJ dalla proteina EhCPADH112 parassita è un prerequisito per E. invasione histolytica che è accompagnato da disfunzione della barriera epiteliale. Pertanto, l'analisi dei meccanismi molecolari coinvolti nella TJ smontaggio durante E. histolytica invasione è di fondamentale importanza per migliorare la nostra comprensione della patogenesi amebiasi. Questo articolo presenta un modello semplice che consente la valutazione delle interazioni iniziali ospite-patogeno e il potenziale parassita invasione. I parametri da analizzare sono transepithelial resistenza elettrica, l'interazione di EhCPADH112 con i recettori di superficie epiteliali, cambiamenti di espressione e la localizzazione di marcatori giunzionale epiteliali e la localizzazione delle molecole del parassita all'interno delle cellule epiteliali.
Introduzione
Entamoeba histolytica è un singolo protozoo responsabile della amebiasi umana, un'infezione intestinale delle cellule causando infiammazione e diarrea. E. histolytica infetta fino a 50 milioni di persone ogni anno, ma solo circa il 10% delle persone infette sviluppano i sintomi associati a amebiasi 1. L'infezione avviene per ingestione di alimenti contaminati o acqua contenente E. cisti histolytica. Nell'intestino, cisti producono trofozoiti vivi che aderiscono al colon mucina e proliferano 2. Trofozoiti di solito si formano le cisti che vengono escreti con feci. In altri casi e per ragioni ancora ....
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Protocollo
1. Creazione e mantenimento di E. Culture histolytica
- Crescere in condizioni asettiche (completamente libero di tutti gli altri organismi contaminanti) 1 x 10 5 trofozoiti di Entamoeba histolytica ceppo HML: IMSS clonare un 18 a 16 x 125 mm tubi di coltura con teflon tappi a vite marittimo di linea (o 1 x 10 6 trofozoiti in un usa e getta T- 25 beuta) e 15 ml (o 50 ml in T-25 pallone) di TYI-S-33 medio (TYI brodo supplementato con 3% Diamante vitamina miscela, siero inattivato bovino adulto 10% calore, 0,5 UI / ml di penicillina e 35 mg / ml streptomicina) 19 in un incubatore a 37 ° C. ....
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Risultati
Per un E. successo cultura histolytica, due importanti condizioni devono essere soddisfatte: la crescita in condizioni axeniche e raccolto in fase logaritmica. In precedenza, colture di E. histolytica erano facilmente stabilita in associazione con alcune specie di batteri o trypanosomatids 22. Tuttavia, al giorno d'oggi è comune avere la coltivazione axenic di questo parassita che significa un subcoltivazione indefinito di amebe in un ambiente privo di batteri che metabolizzano,.......
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Discussione
Per studiare in vitro le interazioni ospite-patogeno in corso di infezione da E. epiteliale histolytica, è fondamentale lavorare con le culture consolidate di entrambe le cellule epiteliali e trofozoiti. Ad esempio, in passato, E. culture histolytica erano stati di solito stabiliti in associazione con alcune specie di batteri o trypanosomatids 22,23. Tuttavia, co-coltivazione di E. culture histolytica è controproducente per lo studio dell.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni dell'Istituto di Scienza e Tecnologia del Distretto Federale (ICyTDF, 64/2012 a EO) e del Consiglio messicano per la scienza e la tecnologia (Conacyt, 179895 a MS).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A | IMSS Hospital, Messico | Senza/numero | Trofozoiti virulenti18 |
| TYI brodo | Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich | 211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879 | 3,45% BBL Biosate peptone 58 mM glucosio 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6,5 mM K2HPO4 16,3 mM acido ascorbico 8,1 mM L-cisteina 0,1 mM citrato di ammonio ferrico, regolare il pH 6,819 |
| Siero bovino adulto | Microlab , Labs., Mex. | SU146 | Utilizzare al 10% e inattivato a 56 ° C per 30 min |
| Miscela di vitamine Diamond - Tween 80 | In vitro | SR-07 | Utilizzare al 3% |
| di penicillina | Riva del lago, Méx. | 34564SSA IV | 0,5 UI/ml |
| Streptomicina | Riva del lago, Méx. | 75757SSA IV | 35 & g/ml |
| Provette per coltura con tappo a vite Pyrex da 15 ml con tappi fenolici rivestiti in PTFE | Corning-Pyrex | 9826-16X | 16 x 125 mm, capacità 15 ml e tappi realizzati con una formula speciale resistente agli effetti della temperatura |
| Piastre per colture cellulari, piastre | Corning-Costar | 3516 | , diametro del pozzetto 34,8 mm e area di crescita 9,5 cm2. Gli anelli sul coperchio impediscono la contaminazione incrociata |
| 25 cm2 pallone per colture cellulari | Corning-Costar | 430168 | Fiasche a collo inclinato |
| MDCK (rene canino Madin Darby) tipo I | Collezione di colture di tipo americano | CCL34 | Cellule epiteliali renali coltivate tra il mezzo DMEM di passaggio 60th e 90th |
| Gibco | 12800-017 | Dulbecco's Modified Eagle Medium ad alto contenuto di glucosio. | |
| Siero di vitello | neonato In vitro | S-02 | Utilizzare al 10%. |
| Miscela penicillina/streptomicina | In vitro | A-01 | Soluzione madre 10.000 U/µ g/ml |
| di insulina | AMSA | 398MJ94SSA IV | Soluzione madre 100 UI/ml |
| Soluzione di tripsina | In vitro | EN-005 | soluzione enzimatica allo 0,05% senza calcio e magnesio |
| 75 cm2 pallone per coltura cellulare | Corning-Costar | 430720 | Palloni a collo inclinato per coltura di trofozoiti in TYI-S-33 supporto permeabile Transwell |
| Corning-Costar | 3470 | 0,4 &; Membrana in poliestere M, inserto da 6,5 mm in piastra a 24 pozzetti, area di crescita 0,3 cm2 | |
| >24 pozzetti | Corning-Costar | 3524 | Polistirene trasparente, trattato per un fissaggio ottimale delle cellule, sterilizzato con radiazioni gamma e certificato non pirogeno |
| Il cocktail completo di | Roche | 11836 153 001 | inibisce un ampio spettro di serina, cisteina e metallo-proteasi. Concentrazione finale 1 mM |
| Trans-epossisuccinil-L-leucilamido (4-guanidino) butano (E-64) | SIGMA-Aldrich | E3132 | Inibitore della proteasi di cisteina, concentrazione finale 40 &; g/ml |
| p&alfa; ZO-1 | Invitrogen | 402200 | Anticorpo policlonale di coniglio IgG contro/un peptide sintetico nella regione centrale della proteina umana ZO-1 |
| m&alfa; EhCPADH112 | Anticorpo fatto in casa | senza/ Numero | di anticorpi monoclonali di topo IgM contro 444-601 epitopo situato al C-terminale di EhCPADH11221,27 |
| FITC-capra-anti-topo IgM | Zymed | 62-6811 | Anticorpo di capra anti-topo marcato con fluoresceina isotiocianato (FITC) |
| TRITC- capra anti-coniglio IgG (H+L) | Zymed | 816114 | Marcato con isotiocianato di tetrametil-rodamina (TRITC) capra anti-coniglio IgG anticorpo secondario. |
| STX2 Strumento | di precisione mondiale degli elettrodi | 102711 | Consiste in una coppia fissa di elettrodi doppi, larghi 4 mm e spessi 1 mm. Ogni bastoncino della coppia di elettrodi contiene un pellet d'argento/cloruro d'argento per misurare la tensione e un elettrodo d'argento per il passaggio della corrente. Da utilizzare con il |
| voltohmmetro epiteliale EVOM EVOM | World Precision Instrument | 12111 | Utilizzare in modalità resistenza e mantenere scollegato durante le misure TER |
| Camera Neubauer | MEARIENFELD | 610610 | Emocitometro |
| Leica TCS_SP5_MO | Leica | Senza/numero | Microscopia confocale laser con Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Terreno di montaggio per fluorescenza |
| 4',6-diammino-2-fenilindolo (Dapi) | SIGMA | D-9542 | 0,05 mM concentrazione finale |
| Albumina sierica bovina (BSA) | US Biological | A-1310 | 0,5% concentrazione finale per soluzione bloccante |
Riferimenti
- Faust, D. M., Guillen, N. Virulence and virulence factors in Entamoeba histolytica, the agent of human amoebiasis. Microbes Infect. 14, 1428-1441 (2012).
- Stauffer, W., Ravdin, J. I. Entamoeba histolytica: an update. Curr Opin Infect Dis. 16, 479-485 (20....
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Ristampe e permessi
