Morphologically- और Neurochemically पहचान Hippocampal interneurons से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग
Summary
Cortical नेटवर्क निरोधात्मक interneurons का एक छोटा सा, लेकिन विविध सेट द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं. Interneurons के कार्यात्मक जांच इसलिए लक्षित रिकॉर्डिंग और कठोर पहचान की आवश्यकता है. Intracellular लेबलिंग, बाद हॉक रूपात्मक और immunocytochemical विश्लेषण के साथ न्यूरॉन्स की एकल या synaptically युग्मित जोड़े से पूरे सेल रिकॉर्डिंग से जुड़े एक संयुक्त दृष्टिकोण है यहाँ का वर्णन किया.
Abstract
GABAergic निरोधात्मक interneurons मस्तिष्क की neuronal सर्किट के भीतर एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं. Interneurons न्यूरोनल जनसंख्या (10-20%) के एक छोटे सबसेट शामिल है, लेकिन उनके विविध कार्यों को दर्शाती है, शारीरिक रूपात्मक, और नयूरोचेमिकल विविधता के उच्च स्तर दिखा. इसलिए, interneurons की जांच महत्वपूर्ण संगठन के सिद्धांतों में अंतर्दृष्टि और neuronal सर्किट के समारोह में प्रदान करता है. यह, हालांकि, व्यक्तिगत interneuron प्रकार का चयन और पहचान के लिए एक एकीकृत शारीरिक और neuroanatomical दृष्टिकोण की आवश्यकता है. Interneuron विशेष मार्कर के प्रमोटरों के तहत फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त ट्रांसजेनिक जानवरों की तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें से रिकॉर्डिंग पूरे सेल पैच दबाना, लक्ष्य और electrophysiologically विशिष्ट interneuron प्रकार की आंतरिक और synaptic गुण चिह्नित करने के लिए एक कारगर तरीका प्रदान करता है. Intracellular डाई लेबलिंग के साथ संयुक्त, इस दृष्टिकोण के बाद हॉक मो के साथ बढ़ाया जा सकता हैrphological और immunocytochemical विश्लेषण, दर्ज न्यूरॉन्स के व्यवस्थित पहचान सक्षम करने से. इन विधियों cortical न्यूरॉन्स के विविध प्रकार के कार्यात्मक संपत्तियों के बारे में वैज्ञानिक सवालों की एक विस्तृत श्रृंखला के अनुरूप किया जा सकता है.
Introduction
हिप्पोकैम्पस neuronal सर्किट लंबे समय के कारण मानव और कृन्तकों दोनों में उनके सीखने और स्मृति में महत्वपूर्ण भूमिका के रूप में भी स्थानिक स्किप शरीर रचना विज्ञान और शरीर विज्ञान, दोनों के लिए सम्मान के साथ, गहन जांच का विषय रहा है. समान रूप से, हिप्पोकैम्पस के प्रमुख, लेकिन सरल लामिना संगठन इस क्षेत्र Cortical नेटवर्क के संरचनात्मक और कार्यात्मक संपत्तियों को संबोधित अध्ययन का एक इष्ट विषय बना देता है.
हिप्पोकैम्पस सर्किट उत्तेजक प्रिंसिपल कोशिकाओं (> 80%) और एक छोटे (10-20%), लेकिन निरोधात्मक interneurons 1-3 की अत्यधिक विविध पलटन के शामिल हैं. Interneurons तेजी ionotropic GABA एक रिसेप्टर्स पर कार्य करता है जो उनके अक्षतंतु टर्मिनलों से γ aminobutyric एसिड (GABA) (GABA एक रुपए) और धीमी metabotropic गाबा बी रिसेप्टर्स (गाबा बी रुपये) जारी 4. ये निरोधात्मक तंत्र उत्तेजना counterbalance और प्रिंसिपल कोशिकाओं के excitability को विनियमित, और इस प्रकारआईआर समय और छुट्टी के पैटर्न. हालांकि, interneurons से जारी गाबा प्रिंसिपल कोशिकाओं पर, लेकिन यह भी interneurons खुद 5,6 पर न केवल काम करता है. पूर्व और पोस्टअन्तर्ग्रथनी रिसेप्टर्स interneuron के विभिन्न प्रकार के बीच प्रतिक्रिया विनियमन और निरोधात्मक आपसी बातचीत में मध्यस्थता. Interneuron नेटवर्क में इन निरोधात्मक तंत्र विभिन्न आवृत्तियों 7 पर विशेष दोलनों में पीढ़ी और जनसंख्या गतिविधि पैटर्न के आकार देने, के लिए केंद्रीय माना जाता है.
पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग आंतरिक गुणों और न्यूरॉन्स की synaptic बातचीत की परीक्षा के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है. हालांकि, interneuron प्रकार की उच्च विविधता के कारण, निरोधात्मक interneurons की जांच दर्ज की कोशिकाओं के कठोर पहचान की आवश्यकता है. हिप्पोकैम्पस interneuron प्रकार अलग रूपात्मक सुविधाओं और नयूरोचेमिकल मार्कर अभिव्यक्ति, संयुक्त शारीरिक और immunocytochemical ई की विशेषता है के रूप मेंxamination सटीक interneuron पहचान 6,8,9 निर्धारित करने के लिए एक साधन प्रदान कर सकते हैं.
वर्तमान पत्र में हम धीमी गाबा बी के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है, एकल न्यूरॉन्स या synaptically युग्मित जोड़े से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के बाद हॉक रूपात्मक और immunocytochemical विश्लेषण द्वारा पीछा किया, intracellular लेबलिंग के साथ संयुक्त कर रहे हैं, जिसमें एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का वर्णन रिसेप्टर पहचान interneurons में निरोधात्मक प्रभाव मध्यस्थता. एक उदाहरण के रूप में, हम अपने पोस्टअन्तर्ग्रथनी लक्ष्यों की सोमा और समीपस्थ डेन्ड्राइट innervates और एक "तेजी से spiking" (एफएस) के द्वारा होती है जो interneuron का एक प्रमुख प्रकार, तथाकथित "टोकरी कोशिकाओं" (ईसा पूर्व) के एक सबसेट, पर ध्यान केंद्रित कैल्शियम बाध्यकारी प्रोटीन parvalbumin (पीवी) 10,11 के पैटर्न, घनी सेल शरीर परत को कवर एक अक्षतंतु, और अभिव्यक्ति का निर्वहन. ये interneurons बड़े पोस्टअन्तर्ग्रथनी निरोधात्मक धाराओं, साथ ही प्रमुख पूर्व प्रदर्शितगाबा बी आर सक्रियण 12 के जवाब में उनके synaptic उत्पादन की synaptic मॉडुलन,. यहाँ वर्णित तकनीक के संयोजन अन्य पहचान न्यूरॉन प्रकार की एक किस्म में आंतरिक या synaptic तंत्र की जांच करने के लिए समान रूप से अच्छी तरह से लागू किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम कार्यात्मक विट्रो में morphologically- और neurochemically पहचान न्यूरॉन्स चिह्नित करने के लिए electrophysiological और neuroanatomical तकनीकों को जोड़ती है जो एक विधि का वर्णन; विशेष रूप से कॉर्टिकल निरोधात्मक आईएनएस के विभिन्न प्रकार के. प्?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों उसे उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए इना Wolter का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. VGAT-वीनस ट्रांसजेनिक चूहों डीआरएस द्वारा उत्पन्न किया गया. डॉ ए Miyawaki द्वारा प्रदान pCS2-वीनस का उपयोग वाई Yanagawa, एम Hirabayashi और राष्ट्रीय शारीरिक विज्ञान के लिए संस्थान, Okazaki, जापान में वाई कावागुची,.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transgenic vGAT-venus rats | – | – | see Uematsu et al., 2008 |
| Venus (515 nm) goggles | BLS Ltd., Hungary | – | – |
| Dissection tools | i.e. FST | – | For brain removal |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation |
| Slice holding chambers | – | – | Custom-made in lab |
| Upright IR-DIC microscope | Olympus, Japan | BX50WI | With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc. |
| CCD camera | Till Photonics | VX55 | |
| 505 nm LED system | Cairn Research | OptiLED system | Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED. |
| Multiclamp 700B | Axon Instruments | Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers | |
| WinWCP acquisition software | John Dempster, Strathclyde University | – | Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc. |
| Electrode Puller | Sutter | P-97 | Used with box-filament |
| Borosilicate pipette glass | Hilgenberg, Germany | 1405020 | 2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls | Other pumps or gravity feed could be used instead |
| Digital Thermometer | – | – | Custom made |
| Digital Manometer | Supertech, Hungary | – | |
| Isolated constant voltage stimulator | Digitimer, Cambridge | DS-2A | – |
| Biocytin | Invitrogen | B1592 | Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine |
| DL-AP5(V) disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120271 | |
| DNQX disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120169 | Alternatively NBQX or CNQX |
| Gabazine (SR95531) | Abcam Biochemicals | ab120042 | Alternatively bicuculline methiodide |
| R-Baclofen | Abcam Biochemicals | ab120325 | |
| CGP-55,845 hydrochloride | Tocris | 1248 | |
| Streptavidin 647 | Invitrogen | S32357 | |
| anti-PV mouse monoclonal antibody | Swant, Switzerland | 235 | Working concentration 1:5000-1:10,000 |
| anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A11030 | If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable. |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000 | |
| Microscopy slides | – | – | Any high quality brand |
| Glass coverslips | – | – | Usually 22 x 22 mm |
| Agar spacers | – | – | Agar block, cut on vibratome to 300 μm |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus, Japan | Fluoview FV1000 | Or other comparable system |
| Fiji (Fiji is just ImageJ) | http://fiji.sc/Fiji | – | See Schindelin et al., 2012 |
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