خلية كاملة تسجيلات التصحيح، المشبك من Morphologically- وحددت Neurochemically-الحصين Interneurons
Summary
يتم التحكم في الشبكات القشرية من قبل مجموعة صغيرة، ولكنها متنوعة من interneurons المثبطة. ولتحقيق الوظيفي للinterneurons يتطلب تسجيل المستهدفة وتحديد دقيق. الموصوفة هنا هو نهج مجتمعة تشمل تسجيلات خلية كاملة من أزواج واحدة أو جانب synaptically من الخلايا العصبية بين الخلايا مع وضع العلامات، خاصة بعد المورفولوجية والتحليل immunocytochemical.
Abstract
GABAergic interneurons المثبطة تلعب دورا مركزيا في الدوائر العصبية في الدماغ. تشمل Interneurons مجموعة فرعية صغيرة من السكان العصبية (10-20٪)، ولكن تظهر مستوى عال من الفسيولوجية، الصرفي، وعدم التجانس الكيميائية العصبية، والتي تعكس وظائفها المتنوعة. لذلك، والتحقيق في interneurons يوفر نظرة ثاقبة على مبادئ تنظيم وظيفة الدوائر العصبية. هذا، ومع ذلك، يتطلب نهجا الفسيولوجية وتشريحي عصبي متكامل لاختيار وتحديد أنواع عصبون الفردية. خلية كاملة تسجيل من شرائح الدماغ الحادة من الحيوانات المعدلة وراثيا، معربا عن بروتينات الفلورسنت تحت المروجين للعلامات عصبون محددة التصحيح، المشبك، ويوفر وسيلة فعالة لاستهداف وelectrophysiologically تميز الخصائص الذاتية ومتشابك من أنواع عصبون محددة. جنبا إلى جنب مع وضع العلامات الصبغة داخل الخلايا، ويمكن تمديد هذا النهج مع ما بعد مو خاصةتحليل rphological وimmunocytochemical، مما يتيح تحديد منهجي من الخلايا العصبية المسجلة. هذه الأساليب يمكن أن تكون مصممة لتناسب مجموعة واسعة من المسائل العلمية المتعلقة بالخصائص الوظيفية لأنواع مختلفة من الخلايا العصبية القشرية.
Introduction
وكانت الدوائر العصبية قرن آمون منذ فترة طويلة موضوع تدقيق مكثف، فيما يتعلق بكل من علم التشريح وعلم وظائف الأعضاء، وذلك بسبب الدور الأساسي في التعلم والذاكرة، فضلا عن الملاحة المكانية في كل من البشر والقوارض. وبالمثل، فإن منظمة الصفحي بارزة، ولكن بسيطة من الحصين يجعل هذه المنطقة وهو موضوع مفضل من الدراسات التي تتناول الخصائص التركيبية والوظيفية للشبكات القشرية.
وتتألف الدوائر من خلايا قرن آمون مثير الرئيسية (> 80٪) وأصغر (10-20٪)، ولكن فوج متنوعة للغاية من interneurons المثبطة 1-3. Interneurons الافراج حامض γ-امينوبوتيريك (GABA) من المحطات محوار بهم الذي يعمل في ionotropic سريع GABA A مستقبلات (GABA A روبية) وبطيئة metabotropic مستقبلات GABA B (GABA B روبية) 4. هذه الآليات المثبطة موازنة الإثارة وتنظيم استثارة الخلايا الرئيسية، وبالتاليتوقيت الأشعة تحت الحمراء ونمط التصريف. ومع ذلك، GABA سراحه من interneurons تعمل ليس فقط على الخلايا الرئيسية، ولكن أيضا على interneurons أنفسهم 5،6. قبل وبعد المشبكي مستقبلات توسط تنظيم ردود الفعل والتفاعلات المتبادلة المثبطة بين أنواع مختلفة من عصبون. ويعتقد أن هذه الآليات المثبطة في شبكات عصبون أن تكون مركزية في جيل وتشكيل أنماط النشاط السكاني، في التذبذبات خاصة على ترددات مختلفة 7.
خلية كاملة تسجيل التصحيح، المشبك هي طريقة راسخة لفحص الخصائص الذاتية والتفاعلات متشابك من الخلايا العصبية. ولكن نظرا لتنوع كبير من أنواع عصبون، والتحقيق في interneurons المثبطة ويتطلب التشخيص الدقيق للخلايا المسجلة. كما تتميز أنواع عصبون قرن آمون بواسطة سمات مميزة المورفولوجية والكيميائية العصبية علامة التعبير، التشريحية مجتمعة والبريد immunocytochemicalيمكن xamination توفر وسيلة لتحديد الهوية الدقيق 6،8،9 عصبون.
في هذه الورقة وصفنا هذا النهج التجريبي الذي يتم الجمع بين خلية كاملة تسجيلات التصحيح المشبك من الخلايا العصبية واحدة أو أزواج جانب synaptically مع وضع العلامات داخل الخلايا، تليها بعد خاصة التحليل الصرفي وimmunocytochemical، مما يسمح لتوصيف بطيئة GABA B مستقبلات بوساطة التأثيرات المثبطة interneurons في تحديدها. وكمثال على ذلك، ونحن نركز على نوع واحد رئيسي للعصبون، مجموعة فرعية من ما يسمى "خلايا سلة" (BC)، والتي يعصب سوما والتشعبات القريبة من أهدافها بعد المشبكي ويتميز "ارتفاعه السريع" (FS) تصريف نمط، محور عصبي تغطي طبقة كثيفة جسم الخلية، والتعبير من البروتين parvalbumin ملزم الكالسيوم (PV) 10،11. تعرض هذه التيارات interneurons المثبطة بعد المشبكي كبيرة، وكذلك قبل بارزتعديل متشابك من إنتاجها متشابك، ردا على GABA B R تفعيل 12. مزيج من الأساليب المذكورة هنا يمكن تطبيق جيد على قدم المساواة للتحقيق آليات فعلية أو متشابك في مجموعة متنوعة من غيرها من أنواع الخلايا العصبية التي تم تحديدها.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن تصف الطريقة التي تجمع بين تقنيات الكهربية وتشريحي عصبي لتوصيف الخلايا العصبية وظيفيا morphologically- وحددت neurochemically في المختبر؛ ولا سيما أنواع متنوعة من الوظائف المثبطة القشرية. الجوانب الرئيسية لهذا الإجراء هي: (1) الاختيار من الوظائف المحتملة؛ (2) تسجيل داخل الخلايا و?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أود أن أشكر إينا فولتر لها المساعدة التقنية الممتازة. تم إنشاؤها VGAT-فينوس الفئران المعدلة وراثيا من قبل الدكاترة. Y. ياناغاوا، M. Hirabayashi وY. كاواجوتشي في المعهد الوطني للعلوم الفسيولوجية، أوكازاكي، اليابان، وذلك باستخدام PCS2-فينوس التي يقدمها الدكتور A. Miyawaki.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transgenic vGAT-venus rats | – | – | see Uematsu et al., 2008 |
| Venus (515 nm) goggles | BLS Ltd., Hungary | – | – |
| Dissection tools | i.e. FST | – | For brain removal |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation |
| Slice holding chambers | – | – | Custom-made in lab |
| Upright IR-DIC microscope | Olympus, Japan | BX50WI | With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc. |
| CCD camera | Till Photonics | VX55 | |
| 505 nm LED system | Cairn Research | OptiLED system | Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED. |
| Multiclamp 700B | Axon Instruments | Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers | |
| WinWCP acquisition software | John Dempster, Strathclyde University | – | Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc. |
| Electrode Puller | Sutter | P-97 | Used with box-filament |
| Borosilicate pipette glass | Hilgenberg, Germany | 1405020 | 2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls | Other pumps or gravity feed could be used instead |
| Digital Thermometer | – | – | Custom made |
| Digital Manometer | Supertech, Hungary | – | |
| Isolated constant voltage stimulator | Digitimer, Cambridge | DS-2A | – |
| Biocytin | Invitrogen | B1592 | Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine |
| DL-AP5(V) disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120271 | |
| DNQX disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120169 | Alternatively NBQX or CNQX |
| Gabazine (SR95531) | Abcam Biochemicals | ab120042 | Alternatively bicuculline methiodide |
| R-Baclofen | Abcam Biochemicals | ab120325 | |
| CGP-55,845 hydrochloride | Tocris | 1248 | |
| Streptavidin 647 | Invitrogen | S32357 | |
| anti-PV mouse monoclonal antibody | Swant, Switzerland | 235 | Working concentration 1:5000-1:10,000 |
| anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A11030 | If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable. |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000 | |
| Microscopy slides | – | – | Any high quality brand |
| Glass coverslips | – | – | Usually 22 x 22 mm |
| Agar spacers | – | – | Agar block, cut on vibratome to 300 μm |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus, Japan | Fluoview FV1000 | Or other comparable system |
| Fiji (Fiji is just ImageJ) | http://fiji.sc/Fiji | – | See Schindelin et al., 2012 |
Riferimenti
- Freund, T. F., Buzsáki, G. Interneurons of the hippocampus. Hippocampus. 6 (4), 347-470 (1996).
- Meyer, A. H., Katona, I., Blatow, M., Rozov, A., Monyer, H. In vivo labeling of parvalbumin-positive interneurons and analysis of electrical coupling in identified neurons. Journal of Neuroscience. 22, 7055-7064 (2002).
- Vida, I., Halasy, K., Szinyei, C., Somogyi, P., Buhl, E. H. Unitary IPSPs evoked by interneurons at the stratum radiatum-stratum lacunosum-moleculare border in the CA1 area of the rat hippocampus in vitro. Journal of Physiolology. 506, 755-773 (1998).
- Mody, I., De Koninck, Y., Otis, T. S., Soltesz, I. Bridging the cleft at GABA synapses in the brain. Trends Neurosci. 17 (12), 517-525 (1994).
- Bartos, M., et al. Fast synaptic inhibition promotes synchronized gamma oscillations in hippocampal interneuron networks. PNAS. 99, 13222-13227 (2002).
- Cobb, S. R., et al. Synaptic effects of identified interneurons innervating both interneurons and pyramidal cells in the rat hippocampus. Neuroscienze. 79 (3), 629-648 (1997).
- Bartos, M., Vida, I., Jonas, P. Synaptic mechanisms of synchronized gamma oscillations in inhibitory interneuron networks. Nature Review Neurosci. 8, 45-56 (2007).
- Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Review Neurosci. 9, 557-568 (2008).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
- Buhl, E. H., Szilágyi, T., Halasy, K., Somogyi, P. Physiological properties of anatomically identified basket and bistratified cells in the CA1 areas of the rat hippocampus in vitro. Hippocampus. 6, 294-305 (1996).
- Kawaguchi, Y., Katsumara, H., Kosaka, T., Heizmann, C. W., Hama, K. Fast spiking cells in rat hippocampus (CA1 region) contain the calcium- binding protein parvalbumin. Brain Res. 416 (2), 369-374 (1987).
- Booker, S. A., et al. Differential GABAB-Receptor-Mediated Effects in Perisomatic- and Dendrite-Targeting Parvalbumin Interneurons. Journal of Neuroscience. 33 (18), 7961-7974 (2013).
- Uematsu, M., et al. Quantitative chemical composition of cortical GABAergic neurons revealed in transgenic Venus-expressing rats. Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R. P., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Houston, C. M., Bright, D. P., Sivilotti, L. G., Beato, M., Smart, T. G. Intracellular Chloride Ions Regulate the Time Course of GABA-Mediated Inhibitory Synaptic Transmission. Journal of Neuroscience. 29 (33), 10416-10423 (2009).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Schindelin, J., et al. Fiji an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Geiger, J. R., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflugers Archives. 443, 491-501 (2002).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
- Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Shunting inhibition improves robustness of gamma oscillations in hippocampal interneuron networks by homogenizing firing rates. Neuron. 49 (1), 107-117 (2006).
- Neu, A., Földy, C., Soltesz, I. Postsynaptic origin of CB1-dependent tonic inhibition of GABA release at cholecystokinin-positive basket cell to pyramidal cell synapses in the CA1 region of the rat hippocampus. Journal of Physiology. 578 (1), 233-247 (2007).
- Baude, A., Bleasdale, C., Dalezios, Y., Somogyi, P., Klausberger, T. Immunoreactivity for the GABAA receptor alpha1 subunit, somatostatin and Connexin36 distinguishes axoaxonic, basket, and bistratified interneurons of the rat hippocampus. Cerebral Cortex. 17, 2094-2107 (2007).
