Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell'ippocampo

Summary

Reti corticali sono controllati da un piccolo, ma diverso insieme di interneuroni inibitori. Indagine funzionale degli interneuroni richiede quindi la registrazione mirata e l'identificazione rigorosa. Qui descritto è un approccio combinato che coinvolge le registrazioni whole-cell da coppie singole o sinapticamente-accoppiati di neuroni con etichettatura intracellulare, post-hoc analisi morfologica e immunocitochimica.

Abstract

Interneuroni inibitori GABAergici svolgono un ruolo centrale nei circuiti neuronali del cervello. Interneuroni comprendono un piccolo sottoinsieme della popolazione neuronale (10-20%), ma mostrano un elevato livello di eterogeneità fisiologica, morfologica, e neurochimici, che riflettono le loro diverse funzioni. Pertanto, l'indagine di interneuroni fornisce importanti informazioni ai principi di organizzazione e funzionamento dei circuiti neuronali. Ciò, tuttavia, richiede un approccio fisiologico e neuroanatomica integrato per la selezione e l'identificazione dei tipi di interneuroni individuali. Whole-cell patch-clamp registrazione da acuta fettine di cervello di animali transgenici, che esprimono proteine ​​fluorescenti sotto i promotori di marcatori specifici di interneuroni, fornisce un metodo efficace per individuare e caratterizzare elettrofisiologicamente proprietà intrinseche e sinaptiche di tipi di interneuroni specifici. Combinato con etichettatura colorante intracellulare, questo approccio può essere esteso con il post-hoc moanalisi rphological e immunocitochimica, consentendo l'identificazione sistematica dei neuroni registrati. Questi metodi possono essere personalizzati per soddisfare una vasta gamma di questioni scientifiche riguardanti le proprietà funzionali dei diversi tipi di neuroni corticali.

Introduction

Circuiti neuronali ippocampali sono da tempo oggetto di intenso esame, per quanto riguarda sia l'anatomia e la fisiologia, a causa del loro ruolo essenziale nell'apprendimento e nella memoria, così come la navigazione spaziale in entrambi gli esseri umani e roditori. Analogamente, l'organizzazione laminare prominente, ma semplice dell'ippocampo rende questa regione un soggetto privilegiato di studi che riguardano proprietà strutturali e funzionali di reti corticali.

Circuiti dell'ippocampo sono costituiti da cellule eccitatorie principali (> 80%) e una più piccola (10-20%), ma altamente diversificata coorte di interneuroni inibitori ^1-3. Interneuroni liberano acido γ-aminobutirrico (GABA) dai loro terminali assoni che agisce a ionotropici veloce recettori GABA _A (GABA _A Rs) e lenti metabotropici GABA _B recettori GABA _B (Rs) ^4. Questi meccanismi inibitori controbilanciano di eccitazione e regolano l'eccitabilità delle cellule principali, e quindi latempi ir e modello di scarico. Tuttavia, GABA rilasciato da interneuroni agisce non solo sulle cellule principali, ma anche sugli stessi interneuroni ^5,6. Recettori pre e post-sinaptici mediano di regolazione di ritorno e inibitori delle interazioni reciproche tra i vari tipi di interneuroni. Questi meccanismi inibitori nelle reti interneuroni sono ritenuti essere centrale per la generazione e la sagomatura di modelli di attività della popolazione, in particolare le oscillazioni a frequenze diverse ^7.

Whole-cell patch-clamp registrazione è un metodo consolidato per l'esame delle proprietà intrinseche e delle interazioni sinaptiche dei neuroni. Tuttavia, a causa della elevata diversità di tipi di interneuroni, ricerca di interneuroni inibitori richiede rigorosa identificazione delle cellule registrate. Come tipi di interneuroni dell'ippocampo sono caratterizzati da elementi particolari morfologici e l'espressione marcatore neurochimico, anatomico combinata e immunocitochimica eSAME può fornire un mezzo per determinare l'identità precisa ^6,8,9 interneuroni.

Nel presente lavoro si descrive un approccio sperimentale in cui whole-cell patch-clamp da neuroni singoli o coppie sinapticamente-accoppiati sono combinati con etichettatura intracellulare, seguito dal post-hoc analisi morfologica e immunocitochimica, permettendo la caratterizzazione di lenta GABA _B recettore mediata effetti inibitori di interneuroni identificati. Come esempio, ci concentriamo su uno dei principali tipi di interneuroni, un sottoinsieme dei cosiddetti "cellule canestro" (BC), che innerva il soma e dendriti prossimali dei suoi obiettivi post-sinaptici ed è caratterizzata da un "spike veloce" (FS) scarico modello, un assone densamente che copre lo strato corpo cellulare, e l'espressione della proteina legante il calcio parvalbumina (PV) ^10,11. Questi interneuroni mostrano grandi correnti inibitorie post-sinaptiche, così come pre prominentemodulazione sinaptica della loro produzione sinaptica, in risposta al GABA _B R di attivazione ^12. La combinazione delle tecniche descritte qui può essere applicato altrettanto bene di indagare i meccanismi intrinseci o sinaptici in una varietà di altri tipi di neuroni identificati.

Protocol

Dichiarazione Etica: tutte le procedure e animale manutenzione sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali, la legge tedesca Animal Welfare, il Consiglio direttiva 86/609 / CEE per quanto riguarda la protezione degli animali europea, e le linee guida delle autorità locali (Berlino, T-0215/11 ) 1 Preparazione di fette acuta-ippocampali Prendete un topo transgenico (da 17 a 24 giorni di età), che esprime la proteina fluorescente Venere / YFP sotto il promot…

Representative Results

A condizione che la qualità fetta è sensibilmente buona, la registrazione da entrambi CA1 PC e FS-in possono essere raggiunti con difficoltà minima. La linea di topo transgenico che esprime Venere / YFP sotto il promotore vGAT 13 non identifica inequivocabilmente FS-in, o anzi jacket. Tuttavia registrazioni da INs in ed intorno a str. piramidale, dove la densità di FS-in è in genere alta 1, si traduce in una elevata probabilità di selezionare FS-in (Figura 2B). FS-in…

Discussion

Descriviamo un metodo che combina tecniche elettrofisiologiche e neuroanatomiche caratterizzare funzionalmente i neuroni morphologically- e neurochimico-identificati in vitro; in particolare i diversi tipi di INs inibitorie corticali. Gli aspetti principali della procedura sono: (1) pre-selezione dei potenziali INs; (2) la registrazione intracellulare e la visualizzazione dei neuroni; e infine (3) analisi morfologica e immunocitochimica di INs registrati. Sebbene questo studio ha affrontato PV-in in particolare, il prot…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transgenic vGAT-venus rats	–	–	see Uematsu et al., 2008
Venus (515 nm) goggles	BLS Ltd., Hungary	–	–
Dissection tools	i.e. FST	–	For brain removal
Vibratome	Leica	VT1200S	Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation
Slice holding chambers	–	–	Custom-made in lab
Upright IR-DIC microscope	Olympus, Japan	BX50WI	With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc.
CCD camera	Till Photonics	VX55
505 nm LED system	Cairn Research	OptiLED system	Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED.
Multiclamp 700B	Axon Instruments		Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers
WinWCP acquisition software	John Dempster, Strathclyde University	–	Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc.
Electrode Puller	Sutter	P-97	Used with box-filament
Borosilicate pipette glass	Hilgenberg, Germany	1405020	2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls	Other pumps or gravity feed could be used instead
Digital Thermometer	–	–	Custom made
Digital Manometer	Supertech, Hungary	–
Isolated constant voltage stimulator	Digitimer, Cambridge	DS-2A	–
Biocytin	Invitrogen	B1592	Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine
DL-AP5(V) disodium salt	Abcam Biochemicals	ab120271
DNQX disodium salt	Abcam Biochemicals	ab120169	Alternatively NBQX or CNQX
Gabazine (SR95531)	Abcam Biochemicals	ab120042	Alternatively bicuculline methiodide
R-Baclofen	Abcam Biochemicals	ab120325
CGP-55,845 hydrochloride	Tocris	1248
Streptavidin 647	Invitrogen	S32357
anti-PV mouse monoclonal antibody	Swant, Switzerland	235	Working concentration 1:5000-1:10,000
anti-mouse secondary antibody	Invitrogen	A11030	If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable.
Normal Goat Serum	Vector Labs	S-1000
Microscopy slides	–	–	Any high quality brand
Glass coverslips	–	–	Usually 22 x 22 mm
Agar spacers	–	–	Agar block, cut on vibratome to 300 μm
Laser scanning confocal microscope	Olympus, Japan	Fluoview FV1000	Or other comparable system
Fiji (Fiji is just ImageJ)	http://fiji.sc/Fiji	–	See Schindelin et al., 2012