갭 접합부 시험에 대한 기능 분석; 인듐 - 주석 산화물에 자기편 세포의 전기 천공 법 (electroporation)
Summary
This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.
Abstract
In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner. Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.
Introduction
셀 전류의 애플리케이션 프로세스라고 일렉트로, 세포막에 구멍을 형성시킨다. 기공이 막을 통한 분자의 nonpermeant 다양한 통로를 허용한다. 전기장이 형성된 기공은 매우 작고 휴대 생리학 방해를 최소화하여, 급속 리 클로즈되도록 정확하게 제어 할 수있다. 흥미롭게도, 부착 세포는 현탁액에 전기 천공 할 분리되지 않고, 그들이 성장 표면에 도전성 투명 인듐 – 주석 산화물 (ITO)로 코팅하고, 반응계에서 electroporation하여 유리 슬라이드 상에 성장 될 수있다. 세포는이 표면 상에 잘 성장할 수 있으며, 이들이 결합하고 확장 한, 상세한 현미경 관찰이 가능하다. 이 기술을 사용하여, 소형 분자 nonpermeant 즉시 도입하고 미리보기의 활성화에 대한 연구를 위해 적합하게이 기술을 세포의 본질적으로 100 %로 할 수있다(1 검토) 수용체의 리간드 자극 다음과 같은 경로의의 onents.
일렉트로는 DNA의 도입 (또한 electrotransfection)에 주로 사용되어왔다. 그러나 현장에서 일렉트로는 전사 인자 바인딩, 또는 siRNA를 3,5 억제하는 등의 안티센스 RNA, 이중 가닥 DNA 미끼 올리고 뉴클레오티드 등의 펩티드 2-4, 올리고 뉴클레오티드 분자의 큰 다양성의 도입을 위해 도움이 될 수 있습니다, 6, 방사성 뉴클레오티드 7-10, 단백질 11 (12) 또는 전구 약물 13. 일렉트로 후, 세포는 생화학 적 분석을 위해 용해 또는 고정 및 항체로 염색 할 수 있습니다.
셀이 전도성 코팅의 가장자리에 걸쳐 증가함에 따라 세포의 성장이,이 표면의 높이 차이에 의해 방해되지 않도록 도전성 ITO 코팅은 800-1,000Å 매우 얇다. 이 장점이 아닌 electrop을 제공합니다orated 세포는 제어 역할을하는, electroporation하여 사람과 나란히 성장시킬 수있다. 비디오에서 설명한 것과 동일한 접근은 갭 접합부, 세포 간 통신 (GJIC)의 검사를 위해 사용될 수있다.
갭 접합 인접 셀 (14)의 내부를 연결하는 채널이다. 이러한에서 Src와 같은 종양 유전자가 GJIC (15, 16)를 억제하면서 갭 접합부는, 세포 간 통신은, 종양 형성 및 전이에 중요한 역할을한다. 루시퍼 옐로우 (LY) 같은 미세 주입을 통해 배양 된 세포에 도입하거나 긁어로드 (17)와 인접 셀에 염료의 확산이 현미경 형광 조명 아래에서 관찰 등의 GJIC에게 형광 염료를 검사합니다. 그러나 이러한 기술은 변함없이 세포 손상을 야기한다. 이제 셀 (18)에 부분적으로 ITO로 코팅 된 유리 슬라이드 상에 성장되는 기법을 설명한다. 전기 펄스 LY (또는 다른 염료)의 존재 캘리포니아 도포인접 비 electroporation하여 세포에 염료 이행는 형광 현미경을 통해 관찰 조명하면서, 상기 슬라이드의 도전 부에 성장 세포로의 침투를 사용. 단일 층으로부터 분리하는 경향이있다 감수성 세포 교란을 방지하기 위해, 전극을 필요로하지 않은 설계되었다 조립체는 전류 (19)를 적용하는 셀의 상단에 배치된다. 혈청 자극 (12) 다음의 G1 단계의 길이에 대한 효과의 부재에 의해 표시된 바와 같이이 방법은 FOS의 수준 증가, 세포 대사에 어떤 검출 가능한 방해하지 않고, 다수의 셀에서 GJIC을 정량 할 수있는 능력을 구비 protooncogene 단백질 (Raptis, 미 출판) 또는 셀룰러 스트레스, P38 돼지 또는 JNK / SAPK 키나제 1과 관련이 키나아제. 종양 유전자 발현 변화와 GJ의 레벨 사이의 링크의 시험이 가능하게 접근IC (18)뿐만 아니라, 폐 종양 표본 20-23 갓 배양 된 세포를 포함하여 다양한 종류의 세포에서 GJIC시에서 Src와 STAT3의 효과. 또한, 기판에 대한 세포 부착은 그 단계에서 환원 19,24되지만, 성공적 adipocytic 분화시 갭 정션 폐쇄 시연에 이용 된 상부 전극을 결여 한 바와 셋업과 동일계에서 일렉트로.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜의 중요한 단계
electroporation하여 재료
전기 천공 할 물질의 순도는 매우 중요하다. 세포가 매우 평탄한 경우 추적 염료의 다음 높은 농도 (20 mg을 LY 대 / ㎖까지)와 같은 경우에 사용되어야하며, 순도가 더욱 중요 더 구형 1 세포에서보다. LY 외에 다른 염료 또는 nonpermeant 분자의 많은 종류가 상이한 connexins 이루어진 25 채널 프로브로 사…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Lowell Cochran for expert videography assistance. The financial assistance of the Canadian Institutes of Health Research (CIHR), the Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), the Canadian Breast Cancer Research Alliance, the Ontario Centers of Excellence, the Breast Cancer Action Kingston and the Clare Nelson bequest fund through grants to LR is gratefully acknowledged. SG was the recipient of an NSERC studentship. MG was supported by a postdoctoral fellowship from the US Army Breast Cancer Program, the Ministry of Research and Innovation of the Province of Ontario and the Advisory Research Committee of Queen’s University.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Cellgro http://www.cellgro.com/ | 50-013-PB | |
| DMEM without Calcium | Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com) | SH30319-01 | |
| Donor Calf Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# B15-008 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# A15-751 | |
| Electroporation apparatus | Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/ | ACE-100 | |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-04-CC | 4-wells |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-08-CC | 8-wells |
| Lucifer Yellow | Cell Projects Ltd UK | ACE-25-LY | High purity |
| CelTak | BD Biosciences | 354240 | Cell and tissue adhesive |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Poly-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
Riferimenti
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