Imágenes de fluorescencia con un nanómetros Precisión (FIONA)

Summary

Fluoróforos individuales pueden ser localizados con precisión nanométrica utilizando FIONA. Aquí se reporta un resumen de la técnica de FIONA, y la forma de llevar a cabo experimentos de FIONA se describe.

Abstract

Imágenes de fluorescencia con una precisión de un nanómetro (FIONA) es una técnica sencilla pero útil para la localización de fluoróforos individuales con precisión nanométrica en el plano xy. Aquí un resumen de la técnica FIONA se informa y ejemplos de investigaciones que se han realizado utilizando FIONA se describen brevemente. En primer lugar, cómo configurar el equipo necesario para los experimentos de FIONA, es decir, un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM), con detalles sobre la alineación de la óptica, se describe. Entonces cómo llevar a cabo un sencillo experimento FIONA en la localización de moléculas individuales de ADN-Cy3 inmovilizada usando protocolos apropiados, seguido por el uso de FIONA para medir el tamaño de paso de 36 nm de un solo miosina Va motor truncada marcada con un punto cuántico, se ilustra. Por último, se informó reciente esfuerzo para extender la aplicación de FIONA para muestras gruesas. Se muestra que, utilizando un objetivo de inmersión en agua y puntos cuánticos empapado profundamente en sol-geles oculares y córneas de conejo (>200 micras), la localización de precisión de 2-3 nm se puede lograr.

Introduction

Alrededor de 1882, Ernst Abbe encontró que la resolución de un microscopio de luz visible es de ~ λ / 2NA, o ~ 200 nm (donde λ es la longitud de onda y NA es la apertura numérica) ^1,2. Por lo tanto cualquier objeto más pequeña que esta dimensión aparecería como un punto de difracción limitada en un microscopio óptico. Sin embargo, es posible determinar el centro de la mancha, es decir, la ubicación del objeto, con una precisión mucho más alta ^3. Imágenes de fluorescencia con una precisión de un nanómetro (FIONA) es una técnica sencilla pero útil para la localización de fluoróforos individuales con precisión nanométrica en el plano xy ^4. La precisión de la localización, _σ μ (es decir, el error estándar de la media), depende del número total de fotones recogidos, , Donde N es el recuento de fotones, s es la desviación estándar de la mancha fluorescente, a esel tamaño de píxel del detector de formación de imágenes, y b es la desviación estándar de los antecedentes ^3,4. Para un fluoróforo que emite fotones ~ 10.000, Fiona puede alcanzar ~ 1 nm de precisión ^4.

FIONA se puede utilizar para determinar con precisión la posición de un emisor fijo, o uno móvil (suponiendo que las imágenes pueden tomarse lo suficientemente rápido). FIONA se puede aplicar secuencialmente a las tramas de la película y por lo tanto seguir el movimiento de la molécula única ^{de 4 8.} Reactivos fotoprotectores pueden ser necesarias para asegurar que la muestra no fotodegrada. Además, el objeto fluorescente en sí puede ser de cualquier tamaño, menor o mayor que la de difracción LIMIT- por ejemplo, puede consistir de un orgánulo (~ 1 m) con muchas proteínas fluorescentes dispersos en su membrana. Usando FIONA todavía puede producir un (nanómetros) promedio muy precisa de su centro de masa media. La gran mejora en la precisión de localización por FIONA permite resolver nanomemovimientos ter-escala en el tiempo. Esto ha empujado a la microscopía en la escala de longitud molecular ^{4 8.}

Desde su invención, se han desarrollado variantes de FIONA. Por ejemplo, las imágenes de campo claro con exactitud de un nanómetro (bFIONA) ^9, una ligera variante de FIONA, imágenes y localiza objetos densos como melanosomas in vivo (objetos oscuros que contienen el pigmento melanina) con luz transmitida. Además, Fiona se ha empleado para resolver múltiples colorantes. Por ejemplo, una sola molécula de alta resolución de imagen con fotoblanqueo (camarones) ^10,11 o de una sola molécula de alta resolución colocalización (SHREC) ¹² se han desarrollado para resolver dos colorantes dentro de aproximadamente 10 nm. (Tenga en cuenta que esta es la resolución, es decir, con qué precisión se puede saber colorantes idénticos aparte.) Más recientemente, el análisis FIONA ha contribuido al proceso de localización de cierta super-resolución de microscopía óptica como reco estocásticomicroscopía nstruction (TORMENTA) ^{13 y 15} y la localización microscopía foto-activado (PALMA) ^16, en el que fluoróforos oscuros temporales están entusiasmados, y luego la fluorescencia se localiza. Por repetidamente emocionante bastante baja densidad de tintes (menos de uno por difracción limitado punto), y luego recoger la fluorescencia, el análisis de cada uno de ellos por Fiona, se puede construir un mapa de alta resolución. La resolución está a continuación, sólo limitado por el número de fotones cada colorante pone a cabo, así como cosas como mantener estacionaria la muestra (incluyendo, por ejemplo, la platina del microscopio) durante la adquisición.

En este trabajo, un resumen de la técnica FIONA y describa brevemente ejemplos de investigaciones que se han realizado utilizando FIONA se informó. En primer lugar, cómo configurar el equipo necesario para los experimentos de FIONA, es decir, un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM), con detalles sobre la alineación de la óptica, se describe. Entonces, ¿cómollevar a cabo un sencillo experimento FIONA sobre la localización de las moléculas individuales de ADN-Cy3 inmovilizada utilizando protocolos apropiados, se ilustra. Después de eso, el uso de FIONA para medir el tamaño de paso de 36 nm de un solo miosina Va motor truncada marcada con un punto cuántico se presenta. La miosina Va es una proteína motora processive esencial que transporta carga celular mientras que a lo largo de los filamentos de actina translocación. Aquí una miosina Va construir truncado se utiliza para eliminar dominios irrelevantes para el tamaño del paso, y con una etiqueta FLAG añadió a la C-terminal para permitir la facilidad de etiquetado con puntos cuánticos funcionalizados con anticuerpos anti-FLAG. Este experimento se realiza en condiciones de baja ATP para ralentizar la miosina y permitir el uso de tiempos de exposición suficientemente largo para conseguir un buen recuento de fotones en cada fotograma. Cualquier marcador fluorescente suficientemente brillante podría ser sustituido en el siguiente protocolo. Por último, se informó reciente esfuerzo de extender la aplicación de FIONA para muestras gruesas. Como prueba de principio-, se empaparon los puntos cuánticosen sol-geles y las córneas de los ojos de conejo y luego fotografiada y localizada usando FIONA. Para imágenes, un objetivo de inmersión 60X agua con NA = 1,2 fue utilizado porque este objetivo tiene una distancia de trabajo de más de 100X objetivo de inmersión en aceite utilizado anteriormente. Para compensar la pérdida en la escala de reproducción en el objetivo, un objetivo extra-ampliación (3.3X o 4,0X) fue colocado en la trayectoria de emisiones. Además, epi-fluorescencia (no TIR) necesita microscopía para ser utilizado para acceder a regiones profundas en las muestras gruesas. Se demuestra que los puntos cuánticos empapados profundo de sol-gel y en las córneas de los ojos de conejo (Z> 200 m) se pueden localizar con 2-3 nm precisión.

Protocol

Declaración de Ética: El tejido de la córnea de conejos se recogió de acuerdo con la Universidad de Illinois Institucional Cuidado de Animales y el uso de directrices. Configuración 1. TIRFM NOTA: Use gafas láser de seguridad todo el tiempo. Asegúrese de que todos los componentes ópticos necesarios que figuran en la Lista de Materiales están disponibles y listos para la alineación. Si es necesario, use sustitutos con funciones equivalentes de…

Representative Results

Una configuración típica TIRFM tipo objetivo se muestra en la Figura 3. En primer lugar, la muestra Cy3-ADN inmovilizado en la superficie fue fotografiada. Una imagen típica se muestra en la Figura 4a. La imagen fue tomada con el tiempo de exposición de 0,5 segundos, con el aumento de EM = 50 y la sensibilidad CCD = 12,13 para la cámara. La propagación–función de punto (PSF) de una sola molécula de Cy3-DNA se muestra en la Figura 4b (desde el punto indicado por…

Discussion

FIONA es una técnica para localizar la posición de un emisor fluorescente (fluoróforo orgánico o punto cuántico) con una precisión nanométrica y resolución temporal a 1 mseg ^{4 8.} Cuando se recojan suficientes fotones, esta técnica permite determinar la posición de un emisor fluorescente mucha más precisión que el límite de difracción (~ 200 nm) y por lo tanto esta técnica abre un camino para observar lo que no se ha visto con el microscopio óptico convencional / tradicional ^{4 – 8.} D…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Double-sided tape	3M	—	~ 75 um thick
EMCCD camera	Andor Technology	DU-897E-CS0-#BV
Ultrasonic cleaner	Branson	2510
Fluorescence filter set	Chroma	49016
Actin polymerization buffer	Cytoskeleton	BSA02
Biotin G-actin	Cytoskeleton	AB07
G-actin	Cytoskeleton	AKL95
General actin buffer	Cytoskeleton	BSA01
Laser shutter (with driver)	Electro-Optical Products Corp.	SH-10-MP
IDL	Exelis Visual Information Solutions	—
Neutravidin	Fisher Scientific	PI-31000
Coverslip	Fisherbrand	22X30-1.5	0.16-0.19 mm thick
Microscope slide	Gold Seal Microslides	30103X1	0.93-1.05 mm thick
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001
Glass bottom dish	In Vitro Scientific	D35-20-1.5-N
Cy3-DNA oligos	Integrated DNA Technologies	—	5'-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3'Bio
Fluorescent beads	Invitrogen	T-7280
Qdot 605-streptavidin	Invitrogen	Q10101MP
Qdot605	Invitrogen	Q21301MP
Qdot705	Invitrogen	Q22021MP
Qdot705 Antibody Conjugation Kit	Invitrogen	Q22061MP
Matlab	MathWorks	—
Optical table	Newport Corp	—	RS4000 Series
60X Objective	Nikon	Plan Apo VC 60x WI
100X Objective	Olympus	PlanApo 100X/1.45 Oil ∞/0.17
60X Objective	Olympus	UPlanApo 60X/1.20W
Inverted microscope	Olympus	IX71/IX70/IX81
Origin	OriginLab	—
Anti-FLAG antibody	Sigma Aldrich	F7425-.2MG
ATP	Sigma Aldrich	A7699
BME	Sigma Aldrich	63689-25ML-F
BSA	Sigma Aldrich	A7906
BSA-biotin	Sigma Aldrich	A8549-10MG
CK	Sigma Aldrich	C3755	Creatine Phosphokinase from rabbit muscle
CP	Sigma Aldrich	P1937	Phosphocreatine di(tris) salt
DTT	Sigma Aldrich	43815	DL-Dithiothreitol
EGTA	Sigma Aldrich	E3889	Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid
HCl	Sigma Aldrich	93363-500G
HEPES	Sigma Aldrich	H0887
KCl	Sigma Aldrich	P9333
MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
PCA	Sigma Aldrich	03930590	Protocatechuic acid
PCD	Sigma Aldrich	P8279	Protocatechuate-3,4-dioxygenase
TMOS	Sigma Aldrich	341436-25G	Tetramethyl orthosilicate
Tris-HCl	Sigma Aldrich	93363
Trolox	Sigma Aldrich	238813	6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid
1” diameter broadband dielectric mirrors with mounts	Thorlabs	BB1-E02, KM100	Quantity: 2
½” diameter posts	Thorlabs	TR4	Quantity ≥ 6
10x beam expander	Thorlabs	BE10M-A
2” diameter broadband dielectric mirrors with mounts	Thorlabs	BB2-E02, KM200	Quantity: 2
2” diameter f = 300 mm lens with mount	Thorlabs	LA1256-A, LMR2	TIR lens
Fluorescent alignment target	Thorlabs	VRC2SM1
Laser safety goggles	Thorlabs	LG3
ND filter(s)	Thorlabs	FW1AND
Optical beam profiler	Thorlabs	BP209-VIS
Post-mounted iris diaphragm	Thorlabs	ID25	Quantity: 2
Shearing interferometer	Thorlabs	SI100
XYZ translation stage, ½” travel	Thorlabs	T12XYZ
Laser	World Star Technologies	TECGL-30	532 nm, 30 mW