受体动力学通过单分子荧光显微镜的高分辨率时空分析
Summary
This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.
Abstract
单分子显微术正在成为一个强大的方法来分析信号分子，特别是关于那些方面（ 如 。，动力学，不同的国家和人群，短暂的相互作用共存），它们通常隐藏在合奏测量，如行为那些与标准生化或显微镜方法获得。因此，动态事件，如受体 – 受体相互作用，可以实时跟踪与高时空分辨率的活细胞。这个协议描述的基础上以小而明亮的有机荧光团和全内反射荧光（TIRF）显微镜直接可视化单一受体的活细胞的表面上的标签的方法。这种方法允许一个精确定位的受体，测定受体复合物的大小，并捕捉动态事件，如瞬时受体 – 受体相互作用。该协议提供了如何PE的详细说明rform单分子实验，包括样品制备，图像采集和图像分析。作为一个例子，这种方法的应用，分析2的G-蛋白偶联受体， 即 ，，β2 -肾上腺素能受体和γ-氨基丁酸B型（GABA B）受体，报道。该协议可以适于其他膜蛋白和不同的细胞模型，转染方法和标记策略。
Introduction
位于细胞表面上的受体感知细胞外环境和各种刺激，如气味分子，离子，小神经递质和大蛋白激素的反应。细胞膜的流体性质允许受体和其他膜蛋白的移动。这是为蛋白质复合物和瞬时蛋白质 – 蛋白质相互作用，如那些用于通过受体组装成的功能单元和信号转导到细胞内发生的形成是必不可少的。例如，G-蛋白偶联受体（GPCR），它构成细胞表面受体1的最大家族，已经提出了以形成di-/oligomers，这似乎是参与信号转导的微调，调节和可能有重要的生理和药理后果2-5。
单分子显微镜具有高spatiotemp直接可视化的巨大潜力口服分辨率位于活细胞，包括其相关联的表面上的单个受体的动态行为，以形成二聚体和更高阶的分子复合物6-10。这比标准的生化和显微镜方法，通常报告的分子数千或数百万的平均行为提供了几个优点。
具有足够明亮，耐光荧光蛋白标记是必不可少的单分子显微镜。该协议需要在近期推出SNAP标签11的优势，以共价连接的小而明亮的有机荧光细胞表面受体。 SNAP是从人类的DNA修复酶的O 6 -烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶，它可以不可逆地标记有荧光团标记的苄基鸟嘌呤（荧光团- BG）衍生物衍生的20 kD蛋白标记。 CLIP，从SNAP派生的进一步工程化标签，可以代替标记荧光基团-Conjugated苄基胞嘧啶衍生物12。
在报道这个手稿的协议说明如何转染和标签SNAP-11标记的受体与小的有机荧光，并使用全内反射荧光（TIRF）显微镜可视化单一受体或受体复合物的活细胞10的表面上。该报告协议结果在细胞外SNAP-标记的细胞表面蛋白10> 90％标记效率。关于如何使用单分子数据来分析受体复合物的大小和流动性，以及捕捉瞬时受体 – 受体相互作用的进一步信息，提供。整个协议的示意流是在图1，作为一个例子，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，SNAP-标签的G-蛋白偶联受体（GPCRs）的转染，然后用荧光团-BG衍生物作为标记以及其应用的量化y和显示器受体di-/oligomerization描述。这个协议可以扩展到其它细胞表面蛋白和荧光标记（ 例如 ，，CLIP），以及其他的转染和标记方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
所描述的协议允许的空间布置，流动性和细胞表面受体复合物的大小在单分子水平的分析。相比，使用荧光蛋白，具有小的有机荧光团，它们是明亮，更耐光的标签，具有允许单个受体粒子的扩展可视化的优点。由于非常低的表达水平得以实现（<0.45受体粒子个/μm2），受体和其他膜蛋白的性质可以在密度不超过生理相关的分析。此外，受体刺激激动剂10或其它操作的影响，例如…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The development of this protocol was supported by grants from the European Research Council (Advanced Grant TOPAS to M.J.L.) and the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grants CA 1014/1-1 to D.C. and SFB487 to M.J.L.). T.S. was supported by the Alexander von Humboldt Foundation.
Materials
| Chloroform | AppliChem GmbH | A1585 | CAUTION: toxic and irritating substance as well as a possible carcinogen |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | CAUTION: strong base and highly corrosive reagent |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Glass coverslip | Marienfeld-Superior | 111640 | 24 mm diameter, 0.13-0.16 mm thickness |
| 0.2 mm sterile filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| CHO cells | ATCC, USA | ATCC CCL-61 | Chinese hamster ovary cell line |
| 6-well cell culture plare | Nunc | 140675 | |
| DMEM/F-12 medium | GIBCO, Life Technologies | 11039-021 | Phenol-red free medium |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S 0115 | |
| Penicillin – streptomycin | Pan Biotech GmbH | P06-07 100 | |
| Trypsin-EDTA | Pan Biotech GmbH | P10-23100 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen, Life Technologies | 31985-047 | |
| Fluorophore-conjugated benzylguanine | New England BioLabs | S9136S | SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Make a 1 mM stock solution in DMSO. Store at -20°C. |
| DMSO | AppliChem GmbH | A1584 | |
| Imaging buffer: | 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterile-filtered | ||
| NaCl | AppliChem GmbH | A1371 | |
| KCl | AppliChem GmbH | A3582 | |
| CaCl2 | AppliChem GmbH | A2303 | |
| MgCl2 | AppliChem GmbH | A3618 | |
| HEPES | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Imaging chamber | Molecular Probes, Life Technologies | A-7816 | Attofluor Cell Chamber, for microscopy |
| TIRF-M | Leica | Model: DMI6000B | |
| TIRF objective | Leica | 11 506 249 | HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR |
| EM-CCD camera | Roper Scientific | Photometrics Cascade 512B | |
| Temperature controller | Pecon | Tempcontrol 37-2 digital | |
| ImageJ software | NIH, USA | http://rsbweb.nih.gov/ij | |
| u-track software | Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | |
| Matlab software | The MathWorks, USA |
Riferimenti
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