Culture<em> Caenorhabditis elegans</em > En Axenic Liquid Media et création d'transgéniques Worms par bombardement de microparticules
Summary
C. elegans est généralement cultivées sur des plaques de gélose solide ou dans des cultures liquides ensemencés avec E. coli. Pour éviter des sous-produits bactériens de confondre les études toxicologiques et nutritionnels, nous avons utilisé un milieu liquide axénique, CEHR, de croître et de synchroniser un grand nombre de vers pour une gamme d'applications en aval.
Abstract
Dans ce protocole, nous présentons les matériaux nécessaires, et la procédure de mise C modifié. Legans e habituation et de reproduction médias (mCeHR). En outre, les étapes de l'exposition et l'acclimatation C. elegans cultivés sur E. coli à axéniques milieux liquides sont décrits. Enfin, des expériences en aval qui utilisent axénique C. elegans illustrent les avantages de cette procédure. La capacité d'analyser et de déterminer C. besoins nutritionnels elegans a été illustrée par la croissance N2 vers de type sauvage dans des milieux liquides axéniques avec des concentrations variables de l'hème. Cette procédure peut être reproduit avec d'autres substances nutritives afin de déterminer la concentration optimale pour la croissance et le développement de la vis sans fin ou, pour déterminer les effets toxicologiques des traitements médicamenteux. Les effets des concentrations d'hème variées sur la croissance des vers de type sauvage ont été déterminés par l'observation microscopique qualitative et en quantifiant til nombre de vers qui poussaient dans chaque concentration de l'hème. En outre, l'effet des concentrations de nutriments variés peut être testée en utilisant des vers qui expriment capteurs fluorescents qui répondent à l'évolution du nutriment d'intérêt. En outre, un grand nombre de vers de terre ont été facilement réalisée pour la génération de C. elegans transgéniques en utilisant un bombardement de microparticules.
Introduction
Le nématode du sol, Caenorhabditis elegans, est un organisme modèle puissant utilisé dans de nombreuses études de la génétique à la toxicologie. En raison de sa taille de 1 mm, le temps de génération rapide de quatre jours, de facilité de culture, et un grand nombre de descendants, ces nématodes ont été utilisés dans un certain nombre de cribles génétiques et pharmacologiques 1, 2. Les chercheurs profitent de ce ver à identifier les molécules et les voies conservés dans les systèmes vertébrés. Ces voies comprennent des signaux de mort cellulaire, les voies de vieillissement et de métabolisme et du système nerveux 6.3. En outre, la transparence de C. elegans permet la génération de lignées transgéniques en utilisant des protéines reporters fluorescents, qui peuvent être visualisées directement pour analyser les modèles d'expression génique et la localisation des protéines.
Dans de nombreuses études ce nématode est cultivée sur une surface à base d'agar-solide en utilisant un milieu de croissance de nématodes (NGM) ou de plaques dans liquid cultures ensemencées avec Escherichia coli en tant que source d'alimentation 7,8. Ces sources alimentaires bactériennes peuvent confondre les études biochimiques et toxicologiques avec l'interférence de sous-produits bactériens qui affectent l'interprétation des résultats. Afin d'éviter ces effets combinés, C. elegans peuvent être cultivées dans un milieu liquide axéniques qui est dépourvu de bactéries en tant que source de nourriture. L'utilisation de ce média, nous avons cultivé avec succès des millions de vers très synchronisées pour beaucoup norme C. protocoles elegans, y compris l'analyse des microréseaux de gènes régulés de manière différentielle dans C. elegans exposée à différentes concentrations d'hème, et la production des vers transgéniques en utilisant un bombardement de gène. Ce support est chimiquement défini et modifié à partir d'une recette originale formulée par le Dr Eric Clegg 9. L'utilisation de ce média mCeHR, nous avons réussi à identifier les gènes impliqués dans l'homéostasie de l'hème, parlé à des gènes sensibles comme l'hème (hrg s) 10, ce qui seraitont pas été possible dans des conditions de croissance réguliers qui utilisent des plaques de gélose NGM ensemencé avec E. coli.
Dans ce protocole, nous décrivons la procédure pour l'introduction et le maintien C. elegans cultivés sur E. coli à la mCeHR axénique et d'utiliser cette méthode pour obtenir un grand nombre de vers de production transgénique C. lignes elegans utilisant un bombardement de microparticules. Nous avons également des études actuelles qui montrent l'utilité de l'utilisation des médias axéniques pour déterminer les besoins nutritionnels de C. elegans en utilisant, par exemple, l'hème. Ces études montrent que l'utilisation de supports mCeHR permet une croissance rapide d'un grand nombre de C. elegans pour de nombreuses applications en aval utilisés par les chercheurs de vers.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous présentons une mCeHR liquide axénique modifié médiatique qui permet rapide C. génération elegans avec production d'un grand nombre de vers. Ce support présente plusieurs avantages que les vers sont cultivés sans contaminer E. coli ou des sous-produits bactériens et peuvent être exploitées dans les études nutritionnelles et toxicologiques. L'utilisation de E. coli ou d'autres bactéries dans ces études a plusieurs inconvénients. Par exe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les National Institutes of HealthGrants DK85035 et DK074797 (IH).
Materials
| MgCl2.6H2O | Sigma | M-2393 | |
| Sodium citrate | Sigma | S-4641 | |
| Potassium citrate.H2O | Sigma | P-1722 | |
| CuCl2.2H2O | Fisher | C455-500 | |
| MnCl2.4H2O | Fisher | M87-100 | |
| ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
| Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O | Sigma | F-1018 | |
| CaCl2.2H2O | Fisher | C70-500 | |
| Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt | Sigma | A-1752 | |
| Cytidine 5 -phosphate | Sigma | C-1006 | |
| Guanosine 2 – and3 -monophosphate | Sigma | G-8002 | |
| Uridine 5 -phosphate, disodium salt | Sigma | U-6375 | |
| Thymine | Sigma | T0376 | |
| N-Acetylglucosamine | Sigma | A3286 | |
| DL-Alanine | Fisher | S25648 | |
| p-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | |
| Biotin | Sigma | B-4639 | |
| Cyanocobalamine (B-12) | Sigma | V-2876 | |
| Folinate (Ca) | Sigma | F-7878 | |
| Niacin | Sigma | N-0761 | |
| Niacinamide | Sigma | N-3376 | |
| Pantetheine | Sigma | P-2125 | |
| Pantothenate (Ca) | Sigma | P-6292 | |
| Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) | ACRCS | 21663-0100 | |
| Pyridoxal 5'-phosphate | Sigma | P-3657 | |
| Pyridoxamine.2HCl | Sigma | P-9158 | |
| Pyridoxine.HCl | Sigma | P-6280 | |
| Riboflavin 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
| Thiamine.HCl | Sigma | T-1270 | |
| DL-6,8-Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | |
| KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
| Choline di-acid citrate | Sigma | C-2004 | |
| myo-Inositol | Sigma | I-5125 | |
| D-Glucose | Sigma | G-7520 | |
| Lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma | L-9010 | |
| Brain Heart Infusion | BD | 211065 | |
| Hemin chloride | Frontier Scientific | H651-9 | |
| HEPES, Na salt | Sigma | H-3784 | |
| Cholesterol | J.T. Baker | F676-05 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| MEM Amino Acids Solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
| Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
| Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
| Gold particles (Au Powder) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
| or | |||
| Gold Particles 1.0 μm | BioRad | 165-2263 |
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