C. elegans is meestal gekweekt op vaste agar platen of in vloeibare culturen bezaaid met E. coli. Om te voorkomen dat bacteriële bijproducten van verstorende toxicologische en nutritionele studies, hebben we gebruik gemaakt van een axenische vloeibaar medium, CeHR, te groeien en te synchroniseren een groot aantal wormen voor een reeks afgeleide toepassingen.
In dit protocol, presenteren we de benodigde materialen, en de procedure voor het maken van aangepaste C. E legans Gewenning en Reproductie media (mCeHR). Bovendien, de stappen voor het blootstellen en acclimatiseren C. elegans gekweekt op E. coli om vloeibare media axenische worden beschreven. Tenslotte downstream experimenten die axenic C. gebruiken elegans illustreren de voordelen van deze procedure. Kunnen analyseren en bepalen C. elegans voedingsstoffen eis werd geïllustreerd door de groeiende N2 wild type wormen in axenische vloeibare media met verschillende concentraties heem. Deze procedure kan worden herhaald met andere voedingsstoffen om de optimale concentratie voor groei en ontwikkeling worm bepalen of de toxische effecten van behandeling met geneesmiddelen te bepalen. De effecten van verschillende concentraties heem op de groei van wildtype wormen werden bepaald door kwalitatieve microscopische waarneming en kwantificeren tHij aantal wormen die groeide in elk heem concentratie. Bovendien kan het effect van verschillende concentraties nutriënten worden getest door gebruik te maken van wormen die fluorescerende sensoren die reageren op veranderingen in de voedingsoplossing van belang uit te drukken. Bovendien werden een groot aantal wormen gemakkelijk geproduceerd voor het genereren van transgene C. elegans met bombardement met microdeeltjes.
De bodem nematode Caenorhabditis elegans, is een krachtige modelorganisme gebruikt in tal van studies van de genetica tot toxicologie. Door de 1 mm grootte, korte generatietijd vier dagen kweekgemak en grote aantallen nakomelingen zijn deze nematoden is gebruikt in een aantal genetische en farmacologische screens 1, 2. Onderzoekers profiteren van deze worm aan moleculen en wegen bewaard in gewervelde systemen te identificeren. Deze routes omvatten celdood signalen, paden van het ouder worden en het metabolisme en het zenuwstelsel 3-6. Bovendien, de transparantie van C. elegans maakt het genereren van transgene lijnen met fluorescerende proteïne reporters, die direct gevisualiseerd kunnen worden om genexpressiepatronen en eiwit lokalisatie analyseren.
In veel studies deze nematode wordt gekweekt op een stevige agar oppervlak met behulp van nematode groeimedium (NGM) platen of in liquid culturen bezaaid met Escherichia coli als voedselbron 7,8. Deze bacteriële voedselbronnen kunnen biochemische en toxicologische studies verwarren met interferentie van bacteriële bijproducten die de interpretatie van de resultaten. Om deze effecten te voorkomen compounding, C. elegans kan worden gekweekt in een axenische vloeibare media die verstoken is van bacteriën als voedselbron. Met behulp van deze media, hebben we met succes gekweekt miljoenen hoogst gesynchroniseerde wormen voor vele standaard C. elegans protocollen waaronder microarray analyse van differentieel gereguleerde genen in C. elegans blootgesteld aan verschillende concentraties heem en productie van transgene wormen middels gen bombardement. Deze media is chemisch gedefinieerd en gewijzigd van een origineel recept van Dr Eric Clegg 9 geformuleerd. Met deze mCeHR media, hebben we met succes geïdentificeerde genen betrokken bij homeostase heem, genoemd heem responsieve genen (HRG s) 10, die zouniet mogelijk geweest in de reguliere groei omstandigheden die NGM agar platen geënt met E. benutten coli.
In dit protocol beschrijven we de procedure voor het invoeren en bijhouden van C. elegans gekweekt op E. coli de axenic mCeHR en gebruik deze methode om een groot aantal wormen te vinden voor het produceren van transgene C. elegans lijnen met behulp van microdeeltjes bombardement. We aanwezig studies die het nut van het gebruik axenic media voor het bepalen van de nutritionele behoefte C. tonen elegans gebruik heem als voorbeeld. Deze studies tonen aan dat het gebruik mCeHR media maakt snelle groei van een groot aantal C. elegans voor vele downstream toepassingen gebruikt door worm onderzoekers.
In dit protocol presenteren we een gemodificeerde axenische vloeibare media mCeHR dat zorgt voor een snelle C. elegans generatie met productie van een groot aantal wormen. Deze media toont een aantal voordelen zoals de wormen worden geteeld zonder vervuilen E. coli of bacteriële bijproducten en kan in voedings-en toxicologisch onderzoek worden benut. Het gebruik van E. coli of andere bacteriën in deze studies heeft verschillende nadelen. Bijvoorbeeld kan de groei van de bacteriën onder vers…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of HealthGrants DK85035 en DK074797 (IH).
MgCl2.6H2O | Sigma | M-2393 | |
Sodium citrate | Sigma | S-4641 | |
Potassium citrate.H2O | Sigma | P-1722 | |
CuCl2.2H2O | Fisher | C455-500 | |
MnCl2.4H2O | Fisher | M87-100 | |
ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O | Sigma | F-1018 | |
CaCl2.2H2O | Fisher | C70-500 | |
Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt | Sigma | A-1752 | |
Cytidine 5 -phosphate | Sigma | C-1006 | |
Guanosine 2 – and3 -monophosphate | Sigma | G-8002 | |
Uridine 5 -phosphate, disodium salt | Sigma | U-6375 | |
Thymine | Sigma | T0376 | |
N-Acetylglucosamine | Sigma | A3286 | |
DL-Alanine | Fisher | S25648 | |
p-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | |
Biotin | Sigma | B-4639 | |
Cyanocobalamine (B-12) | Sigma | V-2876 | |
Folinate (Ca) | Sigma | F-7878 | |
Niacin | Sigma | N-0761 | |
Niacinamide | Sigma | N-3376 | |
Pantetheine | Sigma | P-2125 | |
Pantothenate (Ca) | Sigma | P-6292 | |
Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) | ACRCS | 21663-0100 | |
Pyridoxal 5'-phosphate | Sigma | P-3657 | |
Pyridoxamine.2HCl | Sigma | P-9158 | |
Pyridoxine.HCl | Sigma | P-6280 | |
Riboflavin 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
Thiamine.HCl | Sigma | T-1270 | |
DL-6,8-Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | |
KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
Choline di-acid citrate | Sigma | C-2004 | |
myo-Inositol | Sigma | I-5125 | |
D-Glucose | Sigma | G-7520 | |
Lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma | L-9010 | |
Brain Heart Infusion | BD | 211065 | |
Hemin chloride | Frontier Scientific | H651-9 | |
HEPES, Na salt | Sigma | H-3784 | |
Cholesterol | J.T. Baker | F676-05 | |
MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-076 | |
MEM Amino Acids Solution | Invitrogen | 11130-051 | |
Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
Gold particles (Au Powder) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
or | |||
Gold Particles 1.0 μm | BioRad | 165-2263 |