Dyrkning<em> Caenorhabditis elegans</em > I Axeniske Liquid Media og fremstilling af transgene Worms ved mikropartikelbombardement
Summary
C. elegans er normalt dyrkes på faste agarplader eller i flydende kulturer podet med E. coli. At forebygge bakterielle biprodukter fra confounding toksikologiske og ernæringsmæssige undersøgelser vi udnyttet en aksenisk flydende medium, CeHR, at vokse og synkronisere et stort antal orme for en række efterfølgende anvendelser.
Abstract
I denne protokol, vi præsentere de nødvendige materialer, og proceduren for modificeret C. E legans tilvænning og Reproduktion medier (mCeHR). Derudover trinene for at udsætte og acclimatizing C. elegans dyrket på E. coli Axeniske flydende medier er beskrevet. Endelig downstream eksperimenter, der anvender aksenisk C. elegans illustrerer fordelene ved denne procedure. Evnen til at analysere og afgøre C. Kravet elegans næringsstof blev illustreret ved at dyrke N2 vildtype orme i axeniske flydende medier med varierende hæm koncentrationer. Denne procedure kan gentages med andre næringsstoffer til at bestemme den optimale koncentration for orm vækst og udvikling, eller for at bestemme de toksikologiske virkninger af medicinsk behandling. Virkningerne af varierede hæm koncentrationer på væksten af vildtype orme blev bestemt gennem kvalitative mikroskopisk observation og ved kvantificering than antal orme, der voksede i hver hæm koncentration. Desuden kan virkningen af forskellige koncentrationer af næringsstoffer, der skal analyseres ved anvendelse af orme, der udtrykker fluorescerende sensorer, der reagerer på ændringer i næringsstoffer af interesse. Desuden blev et stort antal orme let fremstilles til generering af transgene C. elegans hjælp mikropartikelbombardement.
Introduction
Jordbunden rundorm, Caenorhabditis elegans, er en kraftig model organisme, der anvendes i en lang række undersøgelser fra genetik til toksikologi. Som et resultat af dens 1 mm størrelse, hurtige generationstid på fire dage, let dyrkning, og store afkom numre, har disse nematoder blevet udnyttet i en række genetiske og farmakologiske skærme 1, 2. Forskere drage fordel af denne orm til at identificere molekyler og veje bevaret i hvirveldyr-systemer. Disse veje omfatter celledød signaler, veje for aldring og stofskifte, og nervesystemet 3-6. Derudover gennemsigtighed C. elegans giver mulighed for generering af transgene linjer ved hjælp af fluorescerende protein reportere, som kan visualiseres direkte at analysere genekspression mønstre og protein lokalisering.
I mange undersøgelser denne nematode dyrkes på en solid agarbaseret overflade ved hjælp nematode medium vækst (NGM) plader eller i liquid kulturer podes med Escherichia coli som en fødekilde 7,8. Disse bakterielle fødekilder kan forvirre biokemiske og toksikologiske undersøgelser med interferens fra bakteriel biprodukter påvirker fortolkningen af resultaterne. For at undgå disse kompoundering virkninger C. elegans kan dyrkes i et axeniske flydende medier, der er blottet for bakterier som en fødekilde. Ved hjælp af dette medie, vi med succes dyrket millioner af meget synkroniserede orme for mange standard C. elegans protokoller herunder microarray analyse af differentielt regulerede gener i C. elegans udsat for forskellige hæm-koncentrationer, og produktionen af transgene orme anvender gen bombardement. Dette medie er kemisk definerede, og modificeret fra en original opskrift formuleret af Dr. Eric Clegg 9. Ved hjælp af denne mCeHR medier, har vi med succes identificeret gener involveret i hæm homeostase, kaldet hæm responsive gener (HRG er) 10, hvilket villehar ikke været muligt i regelmæssige vækstbetingelser, der anvender NGM agarplader podet med E. coli.
I denne protokol beskriver vi proceduren for oprettelse og vedligeholde C. elegans dyrket på E. coli til aksenisk mCeHR og udnytte denne metode til at opnå et stort antal orme til fremstilling af transgene C. elegans linjer ved hjælp af mikropartikelbombardement. Præsenterer vi også undersøgelser, der viser nytten af at bruge axeniske medier til bestemmelse af ernæringsmæssige krav C. elegans hjælp hæm som et eksempel. Disse undersøgelser viser, at ved hjælp af mCeHR medier giver hurtig vækst af et stort antal af C. elegans for mange downstream-applikationer udnyttet af ormen forskere.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokol præsenterer vi en modificeret aksenisk flydende medier mCeHR der giver mulighed for hurtig C. elegans generation med produktion af et stort antal orme. Dette medie viser flere fordele som orme dyrkes uden at forurene E. coli eller bakterielle biprodukter og det kan udnyttes i ernæringsmæssige og toksikologiske undersøgelser. Anvendelsen af E. coli eller andre bakterier i sådanne undersøgelser har flere ulemper. For eksempel kan væksten af bakterierne ændre under …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of HealthGrants DK85035 og DK074797 (IH).
Materials
| MgCl2.6H2O | Sigma | M-2393 | |
| Sodium citrate | Sigma | S-4641 | |
| Potassium citrate.H2O | Sigma | P-1722 | |
| CuCl2.2H2O | Fisher | C455-500 | |
| MnCl2.4H2O | Fisher | M87-100 | |
| ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
| Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O | Sigma | F-1018 | |
| CaCl2.2H2O | Fisher | C70-500 | |
| Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt | Sigma | A-1752 | |
| Cytidine 5 -phosphate | Sigma | C-1006 | |
| Guanosine 2 – and3 -monophosphate | Sigma | G-8002 | |
| Uridine 5 -phosphate, disodium salt | Sigma | U-6375 | |
| Thymine | Sigma | T0376 | |
| N-Acetylglucosamine | Sigma | A3286 | |
| DL-Alanine | Fisher | S25648 | |
| p-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | |
| Biotin | Sigma | B-4639 | |
| Cyanocobalamine (B-12) | Sigma | V-2876 | |
| Folinate (Ca) | Sigma | F-7878 | |
| Niacin | Sigma | N-0761 | |
| Niacinamide | Sigma | N-3376 | |
| Pantetheine | Sigma | P-2125 | |
| Pantothenate (Ca) | Sigma | P-6292 | |
| Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) | ACRCS | 21663-0100 | |
| Pyridoxal 5'-phosphate | Sigma | P-3657 | |
| Pyridoxamine.2HCl | Sigma | P-9158 | |
| Pyridoxine.HCl | Sigma | P-6280 | |
| Riboflavin 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
| Thiamine.HCl | Sigma | T-1270 | |
| DL-6,8-Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | |
| KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
| Choline di-acid citrate | Sigma | C-2004 | |
| myo-Inositol | Sigma | I-5125 | |
| D-Glucose | Sigma | G-7520 | |
| Lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma | L-9010 | |
| Brain Heart Infusion | BD | 211065 | |
| Hemin chloride | Frontier Scientific | H651-9 | |
| HEPES, Na salt | Sigma | H-3784 | |
| Cholesterol | J.T. Baker | F676-05 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| MEM Amino Acids Solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
| Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
| Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
| Gold particles (Au Powder) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
| or | |||
| Gold Particles 1.0 μm | BioRad | 165-2263 |
Riferimenti
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Nass, R., Blakely, R. D. The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration. Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).
- Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C elegans signaling pathways for longevity. Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).
- Kenyon, C. The plasticity of aging insights from long-lived mutants. Cell. 120, 449-460 (2005).
- Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans. Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).
- Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 7, e1002109 (2011).
- Stiernagle, T. Maintenance of C elegans WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-11 (2006).
- Win, M. T., et al. Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations. Aging and disease. 4, 178-185 (2013).
- Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies. East Coast Worm Meeting. , (2002).
- Severance, S., et al. Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 6, e1001044 (2010).
- Rajagopal, A., et al. Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins. Nature. 453, 1127-1131 (2008).
- Nass, R., Hamza, I. Chapter 1 Unit 1 9. The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines. , (2007).
- Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-10 (2013).
- Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).
- Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans. BMC biotechnology. 3, 19 (2003).
- Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction. The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).
- White, C., et al. HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis. Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).
- Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans. Cell. 145, 720-731 (2011).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetica. 157, 1217-1226 (2001).
- Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation. Nucleic acids research. 32, e40 (2004).
- Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection. Nature Methods. 9, 118-119 (2012).
