Dyrking<em> Caenorhabditis elegans</em > I Axenic Flytende Media og Opprettelse av Transgene Worms av mikropartikkel bombardementet
Summary
C. elegans er vanligvis dyrket på fast agar plater eller i flytende kulturer seeded med E. coli. For å hindre bakterie biprodukter fra blander sammen toksikologiske og ernæringsmessige undersøkelser, benyttet vi en axenic flytende medium, CeHR, for å vokse, og synkronisere et stort antall ormer for en rekke nedstrøms applikasjoner.
Abstract
I denne protokollen, presenterer vi de nødvendige materialer, og prosedyren for å lage modifiserte C. E legans Tilvenning og reproduksjon media (mCeHR). I tillegg, er fremgangsmåten for å utsette og acclimatizing C. elegans dyrket på E. coli til axenic flytende medier er beskrevet. Endelig, nedstrøms eksperimenter som utnytter axenic C. elegans illustrere fordelene ved denne prosedyren. Evnen til å analysere og finne C. elegans næringsstoff kravet ble illustrert ved å dyrke N2 vill type ormer i axenic flytende medier med varierende heme konsentrasjoner. Denne prosedyren kan replikeres med andre næringsstoffer for å fastslå den optimale konsentrasjonen for orm vekst og utvikling, eller, for å bestemme de toksikologiske effektene av medikamentell behandling. Virkningene av varierende heme konsentrasjoner på veksten av vill-type ormer ble bestemt ved kvalitativ mikroskopisk observasjon og ved kvantifisering tHan antall ormer som vokste i hvert heme konsentrasjon. I tillegg kan effekten av varierende næringskonsentrasjoner analyseres ved anvendelse av ormer som uttrykker fluorescerende sensorer som reagerer på endringer i det næringsstoffet er av interesse. Videre er et stort antall ormer ble lett fremstilt for generering av transgene C. elegans ved hjelp av mikropartikkel bombardement.
Introduction
Jordsmonnet nematode, Caenorhabditis elegans, er en kraftig modell organisme som brukes i en rekke studier fra genetikk til toksikologi. Som et resultat av dens 1 mm størrelse, hurtig generasjonstid på fire dager, enkle dyrking, og store avkoms tall, har disse nematoder blitt benyttet i en rekke genetiske og farmakologiske skjermer 1, 2. Forskere dra nytte av denne ormen å identifisere molekyler og trasé bevart i virveldyr systemer. Disse banene inkluderer celledød signaler, veier av aldring og metabolisme, og nervesystemet 3-6. I tillegg, gjennomsiktigheten C. elegans tillater generering av transgene linjer ved hjelp av fluorescerende protein journalister, noe som kan være direkte visualisert å analysere genuttrykk mønstre og protein lokalisering.
I mange studier denne nematode er dyrket på en solid agar-baserte overflaten ved hjelp av nematode vekstmedium (NGM) plater eller i lVæsken kulturer seeded med Escherichia coli som matkilde 7,8. Disse bakterielle mat kilder kan forvirre biokjemiske og toksikologiske studier med forstyrrelser fra bakteriell biprodukter som påvirker tolkningen av resultatene. For å unngå disse sammensatte virkninger, C. elegans kan dyrkes i en axenic flytende medier som er blottet for bakterier som matkilde. Ved hjelp av dette mediet, vi får dyrket millioner av svært synkroniserte ormer for mange standard C. elegans protokoller inkludert microarray analyse av differensielt regulerte gener i C. elegans utsatt for ulike heme konsentrasjoner, og produksjon av transgene ormer som bruker genet bombardement. Dette mediet er kjemisk definerte og endret fra en original oppskrift formulert av Dr. Eric Clegg ni. Ved hjelp av denne mCeHR medier, har vi lykkes identifiserte gener involvert i heme homeostase, referert til som heme responsive gener (HRG e) 10, som villehar ikke vært mulig i vanlige vekstbetingelser som utnytter NGM agarplater podet med E. coli.
I denne protokoll beskrives fremgangsmåten for innføring og opprettholdelse C. elegans dyrket på E. coli til axenic mCeHR og benytte denne metode for å oppnå et stort antall ormer for fremstilling av transgene C. elegans linjer ved hjelp av mikropartikkel bombardement. Vi presenterer også studier som viser nytten av å bruke axenic media for å bestemme ernæringsmessige krav om C. elegans hjelp heme som et eksempel. Disse studiene viser at ved bruk av mCeHR media har en rask vekst av et stort antall C. elegans for mange nedstrøms programmer benyttes av ormen forskere.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen presenterer vi en modifisert axenic flytende medier mCeHR som gir mulighet for rask C. elegans generasjon med produksjon av et stort antall ormer. Dette mediet viser flere fordeler som ormene er dyrket uten forurensende E. coli eller bakteriell biprodukter og kan utnyttes i ernæringsmessige og toksikologiske studier. Bruken av E. coli eller andre bakterier i slike studier har flere ulemper. For eksempel, kan veksten av bakteriene endres under forskjellige betingelser, og d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of HealthGrants DK85035 og DK074797 (IH).
Materials
| MgCl2.6H2O | Sigma | M-2393 | |
| Sodium citrate | Sigma | S-4641 | |
| Potassium citrate.H2O | Sigma | P-1722 | |
| CuCl2.2H2O | Fisher | C455-500 | |
| MnCl2.4H2O | Fisher | M87-100 | |
| ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
| Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O | Sigma | F-1018 | |
| CaCl2.2H2O | Fisher | C70-500 | |
| Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt | Sigma | A-1752 | |
| Cytidine 5 -phosphate | Sigma | C-1006 | |
| Guanosine 2 – and3 -monophosphate | Sigma | G-8002 | |
| Uridine 5 -phosphate, disodium salt | Sigma | U-6375 | |
| Thymine | Sigma | T0376 | |
| N-Acetylglucosamine | Sigma | A3286 | |
| DL-Alanine | Fisher | S25648 | |
| p-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | |
| Biotin | Sigma | B-4639 | |
| Cyanocobalamine (B-12) | Sigma | V-2876 | |
| Folinate (Ca) | Sigma | F-7878 | |
| Niacin | Sigma | N-0761 | |
| Niacinamide | Sigma | N-3376 | |
| Pantetheine | Sigma | P-2125 | |
| Pantothenate (Ca) | Sigma | P-6292 | |
| Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) | ACRCS | 21663-0100 | |
| Pyridoxal 5'-phosphate | Sigma | P-3657 | |
| Pyridoxamine.2HCl | Sigma | P-9158 | |
| Pyridoxine.HCl | Sigma | P-6280 | |
| Riboflavin 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
| Thiamine.HCl | Sigma | T-1270 | |
| DL-6,8-Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | |
| KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
| Choline di-acid citrate | Sigma | C-2004 | |
| myo-Inositol | Sigma | I-5125 | |
| D-Glucose | Sigma | G-7520 | |
| Lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma | L-9010 | |
| Brain Heart Infusion | BD | 211065 | |
| Hemin chloride | Frontier Scientific | H651-9 | |
| HEPES, Na salt | Sigma | H-3784 | |
| Cholesterol | J.T. Baker | F676-05 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| MEM Amino Acids Solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
| Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
| Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
| Gold particles (Au Powder) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
| or | |||
| Gold Particles 1.0 μm | BioRad | 165-2263 |
Riferimenti
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Nass, R., Blakely, R. D. The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration. Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).
- Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C elegans signaling pathways for longevity. Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).
- Kenyon, C. The plasticity of aging insights from long-lived mutants. Cell. 120, 449-460 (2005).
- Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans. Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).
- Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 7, e1002109 (2011).
- Stiernagle, T. Maintenance of C elegans WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-11 (2006).
- Win, M. T., et al. Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations. Aging and disease. 4, 178-185 (2013).
- Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies. East Coast Worm Meeting. , (2002).
- Severance, S., et al. Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 6, e1001044 (2010).
- Rajagopal, A., et al. Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins. Nature. 453, 1127-1131 (2008).
- Nass, R., Hamza, I. Chapter 1 Unit 1 9. The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines. , (2007).
- Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-10 (2013).
- Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).
- Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans. BMC biotechnology. 3, 19 (2003).
- Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction. The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).
- White, C., et al. HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis. Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).
- Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans. Cell. 145, 720-731 (2011).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetica. 157, 1217-1226 (2001).
- Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation. Nucleic acids research. 32, e40 (2004).
- Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection. Nature Methods. 9, 118-119 (2012).
