A cultura<em> Caenorhabditis elegans</em > Em Axenic Liquid Media e Criação de transgênicos Worms por bombardeamento com micropartículas
Summary
C. elegans é normalmente cultivadas em placas de agar sólido ou em meio líquido semeadas com E. coli. Para evitar subprodutos bacterianos de confundir os estudos toxicológicos e nutricionais, utilizamos um meio líquido axênico, CEHR, para crescer e sincronizar um grande número de vermes para uma gama de aplicações a jusante.
Abstract
Neste protocolo, apresentamos os materiais necessários, bem como o procedimento para a tomada de C modificado. Legans e habituação e de reprodução da mídia (mCeHR). Além disso, as etapas para expor e aclimatação C. elegans crescidos em E. coli para axênica meios líquidos são descritos. Finalmente, experimentos a jusante que utilizam axênica C. elegans ilustrar os benefícios deste procedimento. A capacidade de analisar e determinar C. elegans exigência nutricional foi ilustrada pelo crescimento N2 tipo selvagem vermes em meio líquido axênicos com concentrações variadas de heme. Este procedimento pode ser replicado com outros nutrientes para determinar a concentração óptima para o crescimento e desenvolvimento de sem-fim ou, para determinar os efeitos toxicológicos de tratamentos com drogas. Os efeitos da concentração do heme variadas sobre o crescimento de tipo selvagem vermes foram determinados por meio de observação microscópica qualitativa e quantificando tele número de vermes que cresciam em cada concentração de heme. Além disso, o efeito de concentrações variadas de nutrientes pode ser ensaiada utilizando vermes que expressam sensores fluorescentes que respondem a alterações nos teores de nutrientes de interesse. Além disso, um grande número de vermes foram facilmente produzida para a geração de C. elegans transgénicos utilizando bombardeamento com micropartículas.
Introduction
O nematóide do solo, Caenorhabditis elegans, é um poderoso organismo modelo utilizado em inúmeros estudos da genética à toxicologia. Como resultado do seu tamanho 1 mm de tempo de geração rápida de quatro dias, a facilidade de cultivo, e um grande número da progenitura, estes nemátodos têm sido utilizados num certo número de telas genéticos e farmacológicos 1, 2. Pesquisadores tirar proveito deste worm para identificar moléculas e vias conservadas em sistemas de vertebrados. Estas vias incluem sinais de morte celular, as vias de envelhecimento e metabolismo, e o sistema nervoso 3-6. Além disso, a transparência da C. elegans permite a geração de linhas transgénicas usando repórteres de proteínas fluorescentes, que podem ser visualizadas directamente para analisar os padrões de expressão de genes e localização de proteínas.
Em muitos estudos desse nematóide é cultivado em uma superfície à base de agar sólido usando nematóide meio de crescimento placas (NGM) ou lculturas iquid semeada com Escherichia coli como uma fonte de alimento 7,8. Estas fontes alimentares bacterianas podem confundir estudos bioquímicos e toxicológicos com a interferência de bactérias subprodutos que afetam a interpretação dos resultados. A fim de evitar estes efeitos combinados, C. elegans podem ser cultivadas num meio líquido axênicos que é desprovido de bactérias como uma fonte de alimento. Usando essa mídia, cultivadas com sucesso milhões de vermes altamente sincronizadas para muitos padrão C. protocolos elegans, incluindo a análise de microarray de genes diferencialmente regulados em C. elegans expostas a diferentes concentrações de heme e a produção de vermes transgénicas usando bombardeamento de genes. Esta mídia é quimicamente definidos e modificados a partir de uma receita original formulada pelo Dr. Eric Clegg 9. Utilizando este suporte mCeHR, identificámos com sucesso genes envolvidos na homeostase do heme, que se refere a genes que respondem a heme (hrg s) 10, o qual farianão ter sido possível em condições de crescimento normais que utilizam placas de agar semeadas com E. NGM coli.
Neste protocolo, descrevemos o procedimento para a introdução e manutenção de C. elegans crescidos em E. coli para o mCeHR axênica e utilizar este método para obter um grande número de vermes para a produção transgénica C. linhas elegans utilizando micropartículas bombardeio. Nós também apresentamos estudos que mostram a utilidade de usar mídia axênicos para determinar a exigência nutricional de C. elegans utilizando heme como um exemplo. Estes estudos mostram que o uso de meios de comunicação mCeHR permite o crescimento rápido de um grande número de C. elegans para muitas aplicações a jusante utilizados por pesquisadores verme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, apresentamos uma mCeHR mídia modificado axênica líquido que permite a rápida C. geração elegans com a produção de um grande número de vermes. Esta mídia mostra várias vantagens como os vermes são cultivados sem contaminar E. coli ou subprodutos de bactérias e pode ser explorada em estudos nutricionais e toxicológicos. O uso de E. coli ou outras bactérias em tais estudos tem vários inconvenientes. Por exemplo, o crescimento das bactérias podem mudar, s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de HealthGrants DK85035 e DK074797 (IH).
Materials
| MgCl2.6H2O | Sigma | M-2393 | |
| Sodium citrate | Sigma | S-4641 | |
| Potassium citrate.H2O | Sigma | P-1722 | |
| CuCl2.2H2O | Fisher | C455-500 | |
| MnCl2.4H2O | Fisher | M87-100 | |
| ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
| Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O | Sigma | F-1018 | |
| CaCl2.2H2O | Fisher | C70-500 | |
| Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt | Sigma | A-1752 | |
| Cytidine 5 -phosphate | Sigma | C-1006 | |
| Guanosine 2 – and3 -monophosphate | Sigma | G-8002 | |
| Uridine 5 -phosphate, disodium salt | Sigma | U-6375 | |
| Thymine | Sigma | T0376 | |
| N-Acetylglucosamine | Sigma | A3286 | |
| DL-Alanine | Fisher | S25648 | |
| p-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | |
| Biotin | Sigma | B-4639 | |
| Cyanocobalamine (B-12) | Sigma | V-2876 | |
| Folinate (Ca) | Sigma | F-7878 | |
| Niacin | Sigma | N-0761 | |
| Niacinamide | Sigma | N-3376 | |
| Pantetheine | Sigma | P-2125 | |
| Pantothenate (Ca) | Sigma | P-6292 | |
| Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) | ACRCS | 21663-0100 | |
| Pyridoxal 5'-phosphate | Sigma | P-3657 | |
| Pyridoxamine.2HCl | Sigma | P-9158 | |
| Pyridoxine.HCl | Sigma | P-6280 | |
| Riboflavin 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
| Thiamine.HCl | Sigma | T-1270 | |
| DL-6,8-Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | |
| KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
| Choline di-acid citrate | Sigma | C-2004 | |
| myo-Inositol | Sigma | I-5125 | |
| D-Glucose | Sigma | G-7520 | |
| Lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma | L-9010 | |
| Brain Heart Infusion | BD | 211065 | |
| Hemin chloride | Frontier Scientific | H651-9 | |
| HEPES, Na salt | Sigma | H-3784 | |
| Cholesterol | J.T. Baker | F676-05 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| MEM Amino Acids Solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
| Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
| Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
| Gold particles (Au Powder) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
| or | |||
| Gold Particles 1.0 μm | BioRad | 165-2263 |
Riferimenti
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