Культивирование<em> Caenorhabditis Элеганс</em > В аксенными жидких сред и создания трансгенных червей бомбардировки микрочастицами
Summary
C. Элеганс обычно выращивают на твердых пластин агара или в жидких культурах затравку Е. палочка. Для предотвращения бактериальных побочных продуктов от оправдав токсикологические и пищевые исследования, мы использовали в аксенными жидкую среду, CeHR, расти и синхронизировать большое количество червей для целого ряда последующих применений.
Abstract
В этом протоколе, мы представляем необходимые материалы, а также порядок внесения модифицированный C. Электронные legans Привыкание и репродукции СМИ (mCeHR). Кроме того, шаги для выявления и акклиматизации C. Элеганс, выращенные на Е. палочка для аксенными жидких сред описаны. Наконец, ниже по течению эксперименты, которые используют аксенными C. Элеганс иллюстрации преимуществ этой процедуры. Умение анализировать и определять C. потребность организма Элеганс было проиллюстрировано растет N2 червей дикого типа в аксенными жидких сред с различными концентрациями гема. Эта процедура может быть воспроизведена с другими питательными веществами для определения оптимальной концентрации для роста и развития червячной или, для определения токсикологических эффектов лекарственной терапии. Эффекты различных концентраций гема на рост червей дикого типа были определены посредством качественного микроскопического наблюдения и путем количественного тон количество червей, которые росли в каждой концентрации гема. Кроме того, эффект от различных концентраций питательных веществ могут быть проанализированы с использованием червей, которые выражают флуоресцентные датчики, которые реагируют на изменения в питательных интересов. Кроме того, большое количество червей были легко получены для получения трансгенных C. Элеганс с использованием бомбардировки микрочастицами.
Introduction
Нематода почвы, Caenorhabditis Элеганс, является мощным модельным организмом используется в многочисленных исследованиях от генетики к токсикологии. В результате такого размера 1 мм, время быстрой генерации четырех дней, легкости культивирования, и большое количество потомства, эти нематоды были использованы в ряде генетических и фармакологических экранов 1, 2. Исследователи воспользоваться этим червем для идентификации молекул и пути консервативные позвоночных систем. Эти пути включают клеточной гибели сигналы, пути старения и метаболизма и нервную систему 3-6. Кроме того, прозрачность C. Элеганс позволяет для генерации трансгенных линиях с использованием флуоресцентного белка журналистам, которые могут быть непосредственно визуализировать проанализировать паттерны экспрессии генов и локализации белков.
Во многих исследованиях это нематода культивируют на твердой основе агара поверхности с помощью нематод роста среды (NGM) пластины или в лiquid культуры засевают кишечной палочки в качестве источника пищи 7,8. Эти бактериальные источники питания может поставить в тупик биохимические и токсикологических исследований с помехами от бактериальной побочных продуктов, влияющих на интерпретацию результатов. Для того чтобы избежать этих рецептуры эффекты, С. Элеганс можно культивировать в аксенными жидких, лишена бактерий как источника пищи. Использование этого носителя, мы успешно культивировали миллионы высоко синхронизированных червей для многих стандартных С. протоколы Элеганс включая микрочипов анализа дифференциально регулируемых генов в С. Элеганс воздействию различных концентраций гема, и производство трансгенных червей, использующих генную бомбардировку. Это СМИ химического состава и редактировался оригинальной рецептуре, сформулированной доктора Эрика Клегг 9. С помощью этого mCeHR носители, мы успешно идентифицированы гены, участвующие в гема гомеостаза, называют гем реагирующих генов (HRG ы) 10, который будетне удалось в обычных условиях роста, которые используют NGM агаром высевают с Е. палочка.
В этом протоколе описываются порядок введения и поддержания C. Элеганс, выращенные на Е. палочка с аксенными mCeHR и использовать этот метод, чтобы получить большое количество червей для получения трансгенного организма C. Элеганс линий с использованием бомбардировки микрочастицами. Мы также представляем исследования, которые показывают целесообразность использования аксенными СМИ для определения питательную требование С. Элеганс используя гем в качестве примера. Эти исследования показали, что использование mCeHR носитель позволяет для быстрого роста большого количества С. Элеганс для многих последующих применений, используемых червячных исследователей.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе мы представляем модифицированную аксенными жидких сред mCeHR, который позволяет для быстрого C. поколение Элеганс с производством большого количества червей. Этот носитель показывает ряд преимуществ, как черви выращиваются без загрязнения E. палочка или б?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальными Институтами HealthGrants DK85035 и DK074797 (IH).
Materials
| MgCl2.6H2O | Sigma | M-2393 | |
| Sodium citrate | Sigma | S-4641 | |
| Potassium citrate.H2O | Sigma | P-1722 | |
| CuCl2.2H2O | Fisher | C455-500 | |
| MnCl2.4H2O | Fisher | M87-100 | |
| ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
| Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O | Sigma | F-1018 | |
| CaCl2.2H2O | Fisher | C70-500 | |
| Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt | Sigma | A-1752 | |
| Cytidine 5 -phosphate | Sigma | C-1006 | |
| Guanosine 2 – and3 -monophosphate | Sigma | G-8002 | |
| Uridine 5 -phosphate, disodium salt | Sigma | U-6375 | |
| Thymine | Sigma | T0376 | |
| N-Acetylglucosamine | Sigma | A3286 | |
| DL-Alanine | Fisher | S25648 | |
| p-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | |
| Biotin | Sigma | B-4639 | |
| Cyanocobalamine (B-12) | Sigma | V-2876 | |
| Folinate (Ca) | Sigma | F-7878 | |
| Niacin | Sigma | N-0761 | |
| Niacinamide | Sigma | N-3376 | |
| Pantetheine | Sigma | P-2125 | |
| Pantothenate (Ca) | Sigma | P-6292 | |
| Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) | ACRCS | 21663-0100 | |
| Pyridoxal 5'-phosphate | Sigma | P-3657 | |
| Pyridoxamine.2HCl | Sigma | P-9158 | |
| Pyridoxine.HCl | Sigma | P-6280 | |
| Riboflavin 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
| Thiamine.HCl | Sigma | T-1270 | |
| DL-6,8-Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | |
| KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
| Choline di-acid citrate | Sigma | C-2004 | |
| myo-Inositol | Sigma | I-5125 | |
| D-Glucose | Sigma | G-7520 | |
| Lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma | L-9010 | |
| Brain Heart Infusion | BD | 211065 | |
| Hemin chloride | Frontier Scientific | H651-9 | |
| HEPES, Na salt | Sigma | H-3784 | |
| Cholesterol | J.T. Baker | F676-05 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| MEM Amino Acids Solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
| Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
| Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
| Gold particles (Au Powder) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
| or | |||
| Gold Particles 1.0 μm | BioRad | 165-2263 |
Riferimenti
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Nass, R., Blakely, R. D. The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration. Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).
- Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C elegans signaling pathways for longevity. Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).
- Kenyon, C. The plasticity of aging insights from long-lived mutants. Cell. 120, 449-460 (2005).
- Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans. Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).
- Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 7, e1002109 (2011).
- Stiernagle, T. Maintenance of C elegans WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-11 (2006).
- Win, M. T., et al. Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations. Aging and disease. 4, 178-185 (2013).
- Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies. East Coast Worm Meeting. , (2002).
- Severance, S., et al. Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 6, e1001044 (2010).
- Rajagopal, A., et al. Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins. Nature. 453, 1127-1131 (2008).
- Nass, R., Hamza, I. Chapter 1 Unit 1 9. The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines. , (2007).
- Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-10 (2013).
- Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).
- Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans. BMC biotechnology. 3, 19 (2003).
- Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction. The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).
- White, C., et al. HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis. Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).
- Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans. Cell. 145, 720-731 (2011).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetica. 157, 1217-1226 (2001).
- Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation. Nucleic acids research. 32, e40 (2004).
- Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection. Nature Methods. 9, 118-119 (2012).
