माउस वृषण की विवो Microinjection और electroporation में

Summary

वृषण माउस कोशिकाओं के लिए एक अभिकर्मक तकनीक शुक्राणुजनन की अद्वितीय प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के रूप में इस अनुच्छेद विवो में microinjection और माउस वृषण की electroporation वर्णन करता है. प्रस्तुत प्रोटोकॉल electroporation द्वारा गिलास केशिका तैयारी, अपवाही वाहिनी के माध्यम से microinjection, और अभिकर्मक के कदम शामिल है.

Abstract

यह वीडियो और लेख योगदान microinjection और vivo में माउस वृषण की electroporation के लिए एक व्यापक विवरण देता है. वृषण माउस कोशिकाओं के लिए यह विशेष रूप से अभिकर्मक तकनीक शुक्राणुजनन में अद्वितीय प्रक्रियाओं के अध्ययन की अनुमति देता है.

निम्नलिखित प्रोटोकॉल प्लाज्मिड निर्माणों साथ वृषण माउस कोशिकाओं के अभिकर्मक पर केंद्रित है. विशेष रूप से, हम लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (DsRed2) व्यक्त हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) और भी pDsRed2-N1 वेक्टर बढ़ाया व्यक्त जो रिपोर्टर वेक्टर pEGFP-C1, इस्तेमाल किया. दोनों इनकोडिंग रिपोर्टर जीन मानव cytomegalovirus तत्काल जल्दी प्रमोटर (सीएमवी) के नियंत्रण में थे.

माउस वृषण में जीन स्थानांतरण प्रदर्शन के लिए, संवाददाता प्लाज्मिड निर्माणों में रहने वाले चूहों के वृषण में इंजेक्ट किया जाता है. कि अंत करने के लिए, एक anaesthetized जानवर के वृषण संपर्क में है और microinjection की साइट तैयार किया जाता है. की हमारी पसंदीदा जगहइंजेक्शन वृषण और अधिवृषण के बीच शुक्राणुओं की संरचनात्मक परिवहन मार्ग के रूप में अंत में जुड़ा हुआ जाल वृषण साथ, अपवाही वाहिनी है. इस तरह, microinjection के बाद बीजदार नलिकाओं के भरने उत्कृष्ट कारण दाग डीएनए समाधान का उपयोग करने में कामयाब रहे और नियंत्रित किया जाता है. अपनी रंगीन छोटी नली संरचना से वृषण की पर्याप्त भरने देखने के बाद, अंग electroporated है. यह वृषण कोशिकाओं में डीएनए समाधान के हस्तांतरण के लिए सक्षम बनाता है. ऊष्मायन के 3 दिन बाद, वृषण निकाल दिया जाता है और अभिकर्मक सफलता illustrating, हरी या लाल प्रतिदीप्ति के लिए खुर्दबीन के नीचे की जांच की.

आम तौर पर, इस प्रोटोकॉल DNA- या RNA- पहुंचाने के लिए नियोजित किया जा सकता क्रम में रहने वाले माउस वृषण में constructs (अधिक) व्यक्त या विवो जीन समारोह विश्लेषण में सुविधा जीन नीचे दस्तक. इसके अलावा, यह संवाददाता निर्माणों या ख्यात जीन नियमों के अध्ययन के लिए उपयुक्त हैइतिहास तत्वों. इस प्रकार, electroporation तकनीक का मुख्य लाभ वैकल्पिक तकनीकों की तुलना में आवश्यक कम प्रयास के साथ ही मध्यम तकनीकी उपकरण और कौशल के साथ संयोजन में तेजी से प्रदर्शन कर रहे हैं.

Introduction

स्तनधारी शुक्राणुजनन परिपक्व अगुणित शुक्राणु में विकसित करने के क्रम में क्रमिक पिंजरे का बँटवारा, अर्धसूत्रीविभाजन और भेदभाव के दौर से गुजर स्वयं renewing स्टेम कोशिकाओं के एक परिष्कृत प्रक्रिया माना जाता है. इन morphological परिवर्तन विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं द्वारा करवाया जाता है और गहन प्रयासों के बावजूद, यह सेल संस्कृति ^1,2 में इन प्रक्रियाओं की नकल करने के लिए अभी असंभव है. इसलिए, अब तक शुक्राणुजनन पर अनुसंधान में vivo मॉडल के रूप में रहने वाले जीवों पर निर्भर करता है. सामान्य में, जीन समारोह पढ़ाई आमतौर पर ट्रांसजेनिक जानवरों पर आधारित हैं. हालांकि, सृजन और पशु मॉडल के इस तरह बनाए रखने के लिए समय लेने वाली है, लागत गहन और काफी विस्तृत है. यह सृजन और पीढ़ियों पर transgene बनाए रखने के लिए आवश्यक लंबे प्रजनन प्रक्रिया को जिम्मेदार ठहराया है. साथ ही, ट्रांसजेनिक या पीटा दृष्टिकोण से पूरे जीव की आनुवंशिक हेरफेर जी को लक्ष्य बनाते समय शारीरिक विकलांगता के कारण होने की संभावना हैजैसे कई क्षेत्रों में आवश्यक कार्यों, वृषण बाहर या प्रणालीबद्ध साथ Enes.

इसके अलावा, कुछ क्षणिक अभिकर्मक तरीकों कुछ महत्वपूर्ण नुकसान के साथ जुड़े रहे हैं. Lipofection ³ और microparticle बमबारी ⁴ ऊतकों को नुकसान पहुंचा सकता है और पर्याप्त अभिकर्मक दक्षता के लिए एक निश्चित सेल गहराई तक ही सीमित हैं, जबकि उदाहरण के लिए, वायरस की मध्यस्थता जीन स्थानांतरण के विशिष्ट कमियां, immunoreactions और अतिरिक्त सुरक्षा नियमों के संभावित उकसावे हैं.

इसके विपरीत, क्षणिक अभिकर्मक की एक आम रास्ता के रूप में electroporation (ईपी), विवो अभिकर्मक और लगातार vivo में जीन विश्लेषण में सक्षम बनाने के लिए एक आशाजनक तकनीक का गठन करने के लिए लगता है. सामान्य में, ईपी nanoseconds के भीतर फलस्वरूप मध्यस्थता pores के साथ स्थानीय transmembrane वोल्टेज पर निर्भर करता है कि एक गतिशील घटना के रूप में जाना जाता है. इन खामियों को दूर मिसे के लिए बनाए रखा जा सकता है, पर्याप्त टीओ डीएनए, आरएनए या छोटे अणुओं ⁵ तक पहुंच प्रदान करें. लागू वोल्टेज बहुत अधिक है, जब ईपी का आमतौर पर क्षणिक चरित्र के कारण गर्मी उत्पादन और सेल ⁵ के फलस्वरूप अपरिवर्तनीय क्षति के साथ भी व्यापक permeabilization के शामिल होने के लिए counteracted है.

यहाँ, हम electroporation vivo में वृषण जीन विशेषताओं को स्पष्ट करने के क्रम में आनुवंशिक वृषण परिवर्तन के लिए उपयोग किया जा रहा करने में सक्षम है जो एक प्रभावी और किफायती अभिकर्मक प्रणाली है कि दिखा. यह लेख अपवाही वाहिनी और माउस वृषण के बाद electroporation के माध्यम प्लाज्मिड तैयारी, microinjection पते. यह प्रक्रिया शुक्राणुजनन की प्रक्रियाओं की जांच करने के क्रम में vivo में माउस वृषण की बीजदार नलिकाओं में तेजी का विशिष्ट और कुशल अभिकर्मक प्राप्त करने के लिए विकल्प के साधन हो सकता है.

Protocol

सभी प्रदर्शन पशु प्रयोगों स्थानीय आचार समिति (Landesamt फर Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, Mecklenburg-Vorpommern, जर्मनी) द्वारा अनुमोदित किया गया है. 1 प्लाज्मिड तैयारी प्लाज्मिड तैयारी के लिए, प्लाज्मिड शुद्धि किट (?…

Representative Results

यह प्रयोग किया जाता है के रूप में vivo में माउस वृषण के microinjection और electroporation प्रदर्शन प्रोटोकॉल के अनुसार के लिए प्रयोगात्मक सेटिंग यह औद्योगिक रूप से निर्मित micropipettes प्राप्त करने के लिए संभव है. हालांकि चि?…

Discussion

विशेष रूप से पुरुष प्रजनन क्षमता और अनिवार्य रूप से शुक्राणुजनन के क्षेत्र में प्रजनन जीव विज्ञान के क्षेत्र में अनुसंधान रहने वाले जीवों पर निर्भर करता है. वृषण समारोह की जांच करने के लिए, कोई पर्याप?…

Materials

centrifuge	Sigma	1-15 PK
spectrophotometer	Nanodrop	ND-1000
micropipette puller	Narishige	PC-10	vertical capillary puller
microinjection capillaries	Clark	GC100-10	borosilicate standard wall
micropipette beveler	Bachofer	Typ 462	rotating disk beveler
electroporator	Nepagene	CUY 21EDIT	square wave electroporator
tweezer electrodes	Nepagene	CUY 650P5	5 mm Ø disk electrodes
stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000-C
cold light source	Zeiss	KL 1500LCD
microinjection pump	Eppendorf	Femtojet
micromanipulator	homemade		XYZ cross table
surgical instruments	FST		scissors, forceps, needle holder
fine forceps	FST	Dumont #5, #7	efferent ducts preparation
Michel clip applying stapler	FST	Michel, 12029-12
Michel suture clips	FST	Michel, 12040-01	7.5 x 1.75 mm
surgical suture	Catgut 00	Catgut Markenkirchen
syringe, with 30G needle	B. Braun	Omnican 40	to load micropipette and for anesthesia
plasmid isolation kit	Promega	Cat. # A2495	plasmid Midiprep
plasmid pEGFP-C1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + EGFP
plasmid pDsRed2-N1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + DsRed2
Fast Green dye	Sigma	F7258-25G	for dilution in ddH2O
10x PBS, pH 7.4	Carl Roth	3957.1	NaCl [1.37 M]
6781.1	KCl [27 mM]
T106.2	Na2HPO4+2H2O [100 mM]
3904.1	KH2PO4 [18 mM]
10% Ketamin	Serum Werk Bernburg	Urotamin	mix in a rate 1:1
2% Xylazin	Serum Werk Bernburg	Xylazin
Sterilium	Bode Chemie	Sterillium	disinfection
vet ointment	S&K Pharma GmbH	Kerato Biciron 5% Augensalbe	or similar to prevent dryness of eyes
To-Pro-3 iodide	Invitrogen	T3605