בVivo Microinjection וElectroporation של אשך העכבר

Summary

מאמר זה מתאר microinjection וelectroporation של אשך עכבר in vivo כטכניקת transfection לתאי עכבר אשכים ללמוד תהליכים ייחודיים של יצירת תאי זרע. הפרוטוקול המובא כרוך בצעדים של הכנת זכוכית נימים, microinjection באמצעות צינור efferent, וtransfection ידי electroporation.

Abstract

תרומת וידאו ומאמר זה נותנת תיאור מקיף של microinjection וelectroporation של אשך עכבר in vivo. טכניקת transfection המסוימת הזה לתאי עכבר אשכים מאפשרת המחקר של תהליכים ייחודיים ביצירת תאי זרע.

הפרוטוקול הבא מתמקד בtransfection של תאי עכבר אשכים עם בונה פלסמיד. באופן ספציפי, אנו משמשים וקטור הכתב pEGFP-C1, המבטא משופר חלבון ירוק ניאון (eGFP) וגם וקטור pDsRed2-N1 לבטא חלבון אדום ניאון (DsRed2). שני גני הכתב המקודדים היו תחת שליטתו של אמרגן ציטומגלווירוס האנושי מיידי מוקדם (CMV).

לביצוע העברת גנים לתוך אשכים עכבר, בונה פלסמיד הכתב מוזרקות לתוך אשכים של עכברים חיים. לשם כך, האשכים של בעלי חיים מורדמים חשופים והאתר של microinjection מוכן. המקום המועדף שלנו שלהזרקה היא צינור efferent, עם אשך ךטה" מחובר סופו של דבר כדרך תחבורה האנטומי של תאי הזרע בין האשך ויותרת האשך. בדרך זו, המילוי של אבוביות הזרע לאחר microinjection מנוהל מצוין ומבוקר בשל השימוש בפתרוני DNA מוכתם. לאחר התבוננות מילוי מספק של האשך על ידי מבנה אבובית הצבעוני שלה, האיבר electroporated. זה מאפשר ההעברה של פתרון דנ"א לתוך תאי האשכים. בעקבות 3 ימים של דגירה, האשכים מוסרים ונחקרים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ירוק או אדום, הממחישים את ההצלחה transfection.

באופן כללי, פרוטוקול זה יכול להיות מועסק להעברת דנ"א או RNA- בונה לאשך עכבר חיים כדי (מעל) להביע או להפיל את הגנים, להקל בניתוח תפקוד גן vivo. יתר על כן, הוא מתאים ללימוד מושגי כתב או regula גן המשועראלמנטי טורים. לפיכך, היתרונות העיקריים של טכניקת electroporation הם ביצועים מהירים בשילוב עם מאמץ נמוך, כמו גם הציוד הטכני המתון וכישורים הנדרשים בהשוואה לטכניקות חלופיות.

Introduction

יצירת תאי זרע של יונקים נחשב לתהליך מתוחכם של תאי גזע עצמי חידוש ברציפות עוברים מיטוזה, מיוזה ובידול על מנת להתפתח לתאי זרע הפלואידים בוגרים. שינויים מורפולוגיים אלה בניצוחו של תאים מסוגים שונים ולמרות ניסיונות עמוקים, זה עדיין בלתי אפשרי לחקות את התהליכים הללו בתא התרבות ^1,2. לפיכך, מחקר על יצירת תאי זרע עד עכשיו מסתמך על אורגניזמים חיים כמודלים in vivo. באופן כללי, מחקרי תפקוד הגן מבוססים בדרך כלל על בעלי חיים מהונדסים. עם זאת, יצירה והשמירה של מודל חיה מסוג זה היא זמן רב, עלות אינטנסיבית ומורכבת למדי. זה מיוחס לתהליך הרבייה הארוך הנדרש ליצירת ושמירה על transgene לאורך הדורות. בנוסף, המניפולציה הגנטית של האורגניזם כולו על ידי הגישה המהונדס או נוק אאוט הוא נוטה לגרום לליקויים פיסיולוגיים כאשר מיקוד גרםenes עם פונקציות חיוניות באזורים רבים, למשל, מחוץ לאשך או מערכתי.

יתר על כן, כמה שיטות transfection חולפות קשורות עם כמה חסרונות קריטיים. לדוגמא, חסרונות אופייניים להעברת גנים בתיווך וירוס הם הפרובוקציה האפשרית של immunoreactions ותקנות בטיחות נוספות, ואילו lipofection ³ וmicroparticle הפגזה ⁴ עלולה לגרום נזק לרקמות ומוגבלות לעומק תא מסוים ליעילות transfection מספיק.

בניגוד לכך, electroporation (EP) כדרך נוספת נפוצה של transfection החולף נראה, להוות טכניקה מבטיחה למאפשר בtransfection vivo וin vivo ניתוח גנטי עולה בקנה אחד. באופן כללי, EP נקרא תופעה דינמית שתלוי במתח הטרנסממברני מקומי עם נקבוביות בתיווך כתוצאה מכך בתוך ננו שניות. t פערים אלה יכולים להישמר במשך אלפיות השניה, מספיקo להעניק גישה לDNA, RNA או מולקולות קטנות ^5. כאשר המתח שיושם הוא גבוה מדי, האופי בדרך כלל החולף של EP הוא נוטרל עקב ייצור חום ואינדוקציה של permeabilization המקיף מדי עם נזק בלתי הפיך הסוגר של התא ^5.

כאן, אנו מראים כי electroporation הוא מערכת transfection יעילה וחסכונית שהוא מסוגל להיות מנוצל לשינוי אשך גנטי כדי להבהיר מאפיינים גנטיים אשכי in vivo. מאמר זה עוסק הכנת פלסמיד, microinjection באמצעות צינור efferent וelectroporation הבא של אשך עכבר. הליך זה יכול להיות האמצעי של בחירה כדי להשיג transfection מהיר, ספציפי והיעיל של אבוביות זרע של אשך עכבר in vivo כדי לחקור תהליכים של יצירת תאי זרע.

Protocol

כל הניסויים בבעלי החיים שבוצעו אושרו על ידי הוועדה המקומית האתיקה (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, מקלנבורג מערב פומרניה-, גרמניה). .1 פלסמיד הכנה להכנת פלסמיד, שימוש ערכות פל…

Representative Results

ההגדרה הניסיונית לביצוע microinjection וelectroporation של אשך עכבר in vivo כפי שהוא משמש על פי הפרוטוקול מתוארת באיור 1. למרות שזה אפשרי לרכוש micropipettes תעשייתי מיוצר, העדפנו ליצור טפטפות שלנו על ידי משיכת (איור 1 א ) וbeveling (איור 1 ב) נימי זכוכית, כך שהם מצוי…

Discussion

מחקר בתחום הביולוגיה של רבייה, במיוחד בתחום של פריון ויצירת תאי זרע באופן בלתי נמנע זכר מסתמך על אורגניזמים חיים. על מנת לבחון תפקוד אשכים, אין תרבית תאים מתאימה / מערכת במבחנה כבר נקבעה מסוגל משקף את כל השינויים מורפולוגיים המכריעים מspermatogonium דיפלואידי …

Materials

centrifuge	Sigma	1-15 PK
spectrophotometer	Nanodrop	ND-1000
micropipette puller	Narishige	PC-10	vertical capillary puller
microinjection capillaries	Clark	GC100-10	borosilicate standard wall
micropipette beveler	Bachofer	Typ 462	rotating disk beveler
electroporator	Nepagene	CUY 21EDIT	square wave electroporator
tweezer electrodes	Nepagene	CUY 650P5	5 mm Ø disk electrodes
stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000-C
cold light source	Zeiss	KL 1500LCD
microinjection pump	Eppendorf	Femtojet
micromanipulator	homemade		XYZ cross table
surgical instruments	FST		scissors, forceps, needle holder
fine forceps	FST	Dumont #5, #7	efferent ducts preparation
Michel clip applying stapler	FST	Michel, 12029-12
Michel suture clips	FST	Michel, 12040-01	7.5 x 1.75 mm
surgical suture	Catgut 00	Catgut Markenkirchen
syringe, with 30G needle	B. Braun	Omnican 40	to load micropipette and for anesthesia
plasmid isolation kit	Promega	Cat. # A2495	plasmid Midiprep
plasmid pEGFP-C1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + EGFP
plasmid pDsRed2-N1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + DsRed2
Fast Green dye	Sigma	F7258-25G	for dilution in ddH2O
10x PBS, pH 7.4	Carl Roth	3957.1	NaCl [1.37 M]
6781.1	KCl [27 mM]
T106.2	Na2HPO4+2H2O [100 mM]
3904.1	KH2PO4 [18 mM]
10% Ketamin	Serum Werk Bernburg	Urotamin	mix in a rate 1:1
2% Xylazin	Serum Werk Bernburg	Xylazin
Sterilium	Bode Chemie	Sterillium	disinfection
vet ointment	S&K Pharma GmbH	Kerato Biciron 5% Augensalbe	or similar to prevent dryness of eyes
To-Pro-3 iodide	Invitrogen	T3605