In vivo mikroinjektion och elektroporation av Mus Testikel

Summary

I denna artikel beskrivs mikroinjektion och elektroporering av mus testiklar in vivo som en transfektion teknik för testikel musceller att studera unika processer av spermatogenesen. Den presenterade protokollet involverar stegen att preparatet glaskapillär, mikroinjektion via efferenta kanalen, och transfektering genom elektroporation.

Abstract

Denna video och artikeln bidraget ger en heltäckande beskrivning av mikroinjektion och elektroporering av mus testiklar in vivo. Denna särskilda transfektion teknik för testikel musceller tillåter studiet av unika processer i spermatogenesen.

Följande protokoll är inriktat på transfektion av testikulära musceller med plasmidkonstruktioner. Specifikt använde vi reportern vektor pEGFP-C1, som uttrycker förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) och även pDsRed2-N1 vektor som uttrycker röd fluorescerande protein (DsRed2). Båda kodade reportergener var under kontroll av den humana cytomegalovirus omedelbara-tidiga promotorn (CMV).

För att utföra genöverföring till mus testiklar, är reporter plasmidkonstruktioner injiceras i testiklarna hos levande möss. För detta ändamål är testiklarna på en nedsövd djur exponerad och platsen för mikroinjektion är beredd. Vår bästa ställe förinjektion är den efferenta kanal med slutligen kopplas rete testis som den anatomiska transportväg av spermier mellan testiklarna och bitestiklarna. På detta sätt är fyllningen av sädeskanalerna efter mikroinjektion utmärkt förvaltas och kontrolleras på grund av användningen av färgade DNA-lösningar. Efter att ha observerat en tillräcklig fyllning av testiklarna av dess färgade tubuli struktur, är orgeln electroporated. Detta möjliggör överföring av DNA-lösningen in i de testikulära celler. Efter 3 dagars inkubation, är testiklarna bort och undersöks i mikroskop för grön eller röd fluorescens, illustrerar transfektion framgång.

I allmänhet kan detta protokoll användas för att leverera DNA- eller RNA- konstruktioner i levande mus testiklar för att (över) uttryckliga eller riva gener, underlättar in vivo geners funktion analys. Dessutom är den lämplig för att studera reporterkonstruktioner eller förmodade gen regulatory element. Således de främsta fördelarna med elektrotekniken är snabb prestanda i kombination med låg ansträngning samt den moderata teknisk utrustning och kompetens som krävs i förhållande till alternativa tekniker.

Introduction

Däggdjur spermatogenes anses vara en sofistikerad process för självförnyande stamceller successivt genomgår mitos, meios och differentiering för att utvecklas till mogna haploid spermier. Dessa morfologiska förändringar iscensatt av olika celltyper och trots djupa försök, är det fortfarande omöjligt att efterlikna dessa processer i cellkultur ^1,2. Därför forskning om spermatogenesen hittills bygger på levande organismer som in vivo-modeller. I allmänhet är genen funktionsstudier vanligtvis baserat på transgena djur. Emellertid alstra och upprätthålla denna typ av djurmodell är tidskrävande och kostnadsintensiv och helt genomarbetade. Detta tillskrivs det krävs långa avel att skapa och upprätthålla transgenen över generationerna. Dessutom är genmanipulation av hela organismen av den transgena eller knockout strategi benägna att orsaka fysiologiska nedsättningar när de riktar genes med viktiga funktioner i flera regioner, t.ex. utanför testiklarna eller systemiskt.

Vidare är vissa övergående transfektionsmetoder förknippade med några avgörande nackdelar. Till exempel typiska nackdelarna med virusmedierad genöverföring är det möjligt provokation av immunreaktioner och kompletterande säkerhetsföreskrifter, medan lipofektion ³ och mikropartikelbombardemang ⁴ kan skada vävnad och är begränsade till en viss celldjup för tillräcklig transfektionseffektivitet.

I kontrast, elektroporering (EP) som ett annat vanligt sätt att transient transfektion, tycks utgöra en lovande teknik för att möjliggöra in vivo-transfektion och konsekvent in vivo gen-analys. I allmänhet är EP hänvisas till som en dynamisk fenomen som beror på lokal transmembranspänning med följaktligen medierade porerna inom nanosekunder. Dessa luckor kan bibehållas under millisekunder, tillräcklig to ge tillgång till DNA, RNA eller små molekyler ^5. När den pålagda spänningen är för hög, är vanligen övergående karaktär EP motverkas på grund av värmeproduktionen och induktion av alltför omfattande permeabilisering med åtföljande irreversibel skada på cellen ^5.

Här visar vi att elektroporation är ett effektivt och ekonomiskt transfektion system som är i stånd att utnyttjas för genetisk testis omvandling i syfte att belysa testikulära genprodukter egenskaper in vivo. Denna artikel tar upp beredning plasmid, mikroinjektion via efferenta kanalen och den efterföljande elektroporering av mus testiklar. Detta förfarande kan vara medlet för valet att uppnå snabb, specifik och effektiv transfektion av sädeskanalerna av mus testiklar in vivo för att undersöka processer av spermatogenesen.

Protocol

Alla utförda djurförsök har godkänts av den lokala etiska kommittén (Lande für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, Mecklenburg-Vorpommern, Tyskland). 1. Plasmidberedning För plasmidberedning, använd plasmidrening kit (se Material tabell) eller liknande metoder med endotoxin borttagning buffert så att immunreaktioner av djuret kan undvikas. Följ anvisningarna i handboken. Anställ DDH 2 O att späda plasmiden lösning. Eliminera skr?…

Representative Results

Den experimentella inställning för att utföra mikroinjektion och elektroporering av mus testiklar in vivo eftersom den används i enlighet med protokollet illustreras i figur 1. Även om det är möjligt att få industriellt tillverkade mikropipetter, vi föredrog att skapa våra egna pipetter genom att dra (Figur 1A ) och avfasning (Figur 1B) glaskapillärer så att de försett våra behov. Utrustning för mikroinjektion och elektroporering illustreras i <s…

Discussion

Forskning inom området för reproduktionsbiologi, särskilt inom området av manlig fertilitet och spermatogenes oundvikligen beroende av levande organismer. För att undersöka testikelfunktionen har ingen lämplig cellodling / in vitro-system etablerats kunna reflektera alla viktiga morfologiska förändringar från en diploid spermatogonium till en haploid mogen spermie ^1,2. Således är ofta en nödvändig och som sådan ett värdefullt verktyg i manliga reproduktionsbiologi gen…

Materials

centrifuge	Sigma	1-15 PK
spectrophotometer	Nanodrop	ND-1000
micropipette puller	Narishige	PC-10	vertical capillary puller
microinjection capillaries	Clark	GC100-10	borosilicate standard wall
micropipette beveler	Bachofer	Typ 462	rotating disk beveler
electroporator	Nepagene	CUY 21EDIT	square wave electroporator
tweezer electrodes	Nepagene	CUY 650P5	5 mm Ø disk electrodes
stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000-C
cold light source	Zeiss	KL 1500LCD
microinjection pump	Eppendorf	Femtojet
micromanipulator	homemade		XYZ cross table
surgical instruments	FST		scissors, forceps, needle holder
fine forceps	FST	Dumont #5, #7	efferent ducts preparation
Michel clip applying stapler	FST	Michel, 12029-12
Michel suture clips	FST	Michel, 12040-01	7.5 x 1.75 mm
surgical suture	Catgut 00	Catgut Markenkirchen
syringe, with 30G needle	B. Braun	Omnican 40	to load micropipette and for anesthesia
plasmid isolation kit	Promega	Cat. # A2495	plasmid Midiprep
plasmid pEGFP-C1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + EGFP
plasmid pDsRed2-N1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + DsRed2
Fast Green dye	Sigma	F7258-25G	for dilution in ddH2O
10x PBS, pH 7.4	Carl Roth	3957.1	NaCl [1.37 M]
6781.1	KCl [27 mM]
T106.2	Na2HPO4+2H2O [100 mM]
3904.1	KH2PO4 [18 mM]
10% Ketamin	Serum Werk Bernburg	Urotamin	mix in a rate 1:1
2% Xylazin	Serum Werk Bernburg	Xylazin
Sterilium	Bode Chemie	Sterillium	disinfection
vet ointment	S&K Pharma GmbH	Kerato Biciron 5% Augensalbe	or similar to prevent dryness of eyes
To-Pro-3 iodide	Invitrogen	T3605