C. Dauer-spesifik nöronal Yaptırma Vivo Görüntülemede elegans

Summary

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant ‘dauer’ juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

Abstract

Hayvanlarda stres ile indüklenen fenotipik esneklik kontrol mekanizmaları incelemek için in vivo olarak çoğunlukla kompleks ve zordur. Stres ile indüklenen plastisite klasik bir örneği, C Dauer aşamasıdır elegans. Dauers bakteriyel gıda ve Dauer feromon yüksek konsantrasyonlarının düşük konsantrasyonlarda koşulları altında oluşan alternatif bir gelişim larva bulunmaktadır. Dauers kapsamlı gelişimsel ve davranışsal plastisite gösterir. Örneğin, dört iç dudak kadran bir dizi (IL2Q) nöronları Dauer oluşumu sırasında Reverzibl remodeling tabi tutulur. Büyük ölçekli sıvı nematod kültürlerinden ham Dauer feromonunun üretimi için iyi bilinen çevre yollarını düzenlemeye Dauer girişi, önceden belirlenmiş bir yöntem kullanılarak gösterilmiştir. Bu yöntemle, 50,000 'lik bir konsantrasyon – sıvı kültürü 75,000 nematod / ml bir yüksek ölçüde kuvvetli ham Dauer feromon üretmek için yeterlidir. Ham feromon gücü olan deteBir doz-tepki biyo-tahlil ile rmined. Son olarak, Dauer oluşumu sırasında IL2Qs in vivo zaman atlamalı görüntüleme için kullanılan yöntemler tarif edilmiştir.

Introduction

Gelişimsel ve davranışsal plastisite fenatipik plastisite, olumsuz çevre koşullarına adaptasyonları için önemlidir ve evrim ¹ itici bir güç olarak kabul edilir. C. elegans sık geliştirme ve nörobiyoloji çalışmalar için kullanılan bir model organizmadır. İdeal koşullar altında, C. elegans yetişkin üreme aşamasına başlamadan önce dört larva aşamalardan geçerek gelişir. Ancak, düşük gıda kullanılabilirlik ve yüksek nüfus yoğunluğu, C koşulları altında elegans gelişimsel anahtarı geçmesi ve uzun ömürlü ve stres dayanıklı Dauer evre ² içine girebilirsiniz. Dauers olasılıkla bu stres direnci aracılık olmayan dauers birkaç morfolojik ve davranışsal farklılıklar gösterecektir. Dauer girişi düzenleyen çevre kuyrukları ve genetik yollar yoğun ^{oldu, 5, 4, 3 6, 7} nitelendirdiler. Ancak, bireysel fenotipik değişiklikleri kontrol eden moleküler mekanizmalar d meydana olduğunurada Dauer oluşumu daha az iyi anlaşılmaktadır.

Dauer özgü fenotiplerinin incelenmesi Dauer hayvanların üretimini gerektirir. Bu üç şekilde yapılabilir: 1) C bir açlıktan kültüründen Çekme elegans, 2) Dauer oluşum bünye (Daf-c) mutantlar, arıtılmış feromon sayesinde Dauer oluşumu 3) ndüksiyonunun kullanımı. Bir C ile standart bir NGM plaka ikinci dauers almak için nispeten basit onun bakteriyel gıda arzını tükenmiş elegans nüfus. Elimizde olanlar, standart bir NGM plaka orjinal 3 gün büyümeye bırakıldı ve daha sonra 3 ile aşılanmış Escherichia coli OP50, 50 ul ile tohumlanmış – 4 ergin hermafrodit bireyler bir hafta içinde gıda kaynağı dışarı atmasını sağlar ve birkaç bin üretecek 25 ° C'de tutuldu İlave bir 3 gün içinde dauers (çok sayıda açlıktan olmayan dauers ek olarak). Bununla birlikte, bu yöntem, d içine molt sırasında meydana gelen incelenmesi işlemleri için tatmin edici değildirauer. Bu Dauer girmektedir tipik bir açlıktan plaka üzerinde bir kaç bin hayvan belirlemek zordur. Ayrıca, hasret plaka kullanımı senkronizasyonu için hiçbir imkanı sunuyor. DAF-C mutantlarının kullanımı senkronizasyon ve dauers güvenilir oluşturulmasına izin verir. Ancak, belirli bir Daf-c mutasyonu tek başına veya ek mutasyonlar ile birlikte diğer Dauer özgü fenotipleri etkilemez garantisi yoktur.

Bir Dauer feromon varlığı ilk Cassada ve Russell tarafından ima ve daha sonra Altın ve Riddle tarafından gösterilmiştir. Dauer feromon yana ^kimyasal olarak ^{9, 10 8, 2} karakterize edilmiştir. Arıtılmış feromon farklı şekillerde ^9, bir ham özü Dauer feromon ^11. Kullanımlar sağlar hem hareketsel hem de gelişim süreçleri düzenleyen ascarosides karmaşık bir harmanından oluşur doğal tipte bir arka senkronize dauers güvenilir kontrol indüksiyonu. </p>

Sinir sistemi ve ilişkili glial hücreler Dauer larva oluşumu ^{12, 13, 14} sırasında biçimlenme geçmesi. Bu değişikliklerin bazıları, Dauer ^{13, 14} sırasında glia hücrelerinin yeniden olarak, geri döndürülemez. Ancak, başka biçimlenme olayları olumlu bir dönüş üzerine geri dönüşümlüdür çevre koşulları. Dendrit arborization, multidendritic nöronlar ve akson ¹² biçimlenme tek dendritik bir anahtarı: Örneğin, dört IL2Q nöronların bir dizi dahil Dauer oluşumu sırasında hızlı ve geri dönüşümlü nöronal biçimlenme tabi. Buradaki yöntemler, bir model organizmada strese bağlı nöroplastisitesi güvenilir bir in vivo görüntüleme için izin verir. Üretim ve ham Dauer feromon testleri için sunulan yöntemler, daha önce çeşitli kaynaklardan ^{4, 8, 15, 16, 17, 18} tarif edilen ve derlenmektedir.

Protocol

1. Ham Dauer Feromon Üretimi OP50 E. büyütün Tek bir koloni, O / N 37 ° C 'de E. coli 200 rpm'de LB suyu 100 ml çalkalandı. NOT: Bu göre O / N kültür önceden yapılmış ve 4 ° C'de saklanabilir. N2 C büyütün elegans, 15 – 20 OP50 E: 50 ul NGM ağarma (Tablo 1 'de tarif bak) ile 6 cm Petri kapları coli bakteri kadar neredeyse 19 tükenmiş. 1 L Erlenmeyer'de S medya 5x 250 ml (Tablo 1 tarif…

Representative Results

Isı, soğuk ve stabil olarak sarı bir sıvı ham Dauer feromon sonuçları (Şekil 1) üretimi. Ham feromon alikotlar aktivitesinde belirgin bir kayıp olmadan, süresiz olarak -20 ° C'de saklanır. Feromonun üretiminin ardından, tekli bir doz-yanıt potens biyolojik tayin, kaba bir tahmin için yeterlidir. 3 kez ve her deneyde bir ortalamasını alın – Bununla birlikte, çoğu deneyleri için bu biyo-analizi tekrar 2 için gereklidir. Iki feromon biyoanalizlere Temsilcisi sonuçları …

Discussion

Dauer özgü nöroplastik Dauer ve diğer ilişkili morfolojik değişikliklerin bir inceleme kontrol edilebilir ve her iki genetik mutasyon (örneğin, DAF,-C mutantları) vasıtasıyla veya feromon vahşi tip hayvanların maruz bırakılarak dauers güvenilir oluşturulmasını gerektirir. Dauers ikna etmek için bir genetik mutasyon kullanımı uygun olsa da, bu sonuçlar yanıltabilecek. Bu nedenle Daf-c mutasyonlar ile toplanan veriler daha sonra Dauer feromon maruz Dauer sahne girmek için uyarı…

Materials

N2 C. elegans Bristol strain	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	Upon request from Schroeder lab
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	Upon request from Schroeder lab
JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Petri dishes	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Various		3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 mL H2O autoclaved cooled to 55°C followed by 1 mL of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 mL of 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 1 mL of 1 M CaCl2, 1 mL of 1 M MgSO4
S Media	Various		S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5 g KH2PO4, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H2O to 250 mL. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 mL of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate, H2O to 100 mL, autoclaved), 2.5 mL of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO4 •7 H2O, 0.2 g MnCl2•4 H2O, 0.29 g ZnSO4 •7 H2O, 0.025 g CuSO4 •5 H2O, H2O to 1 liter. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 mL of 1 M CaCl2, and 0.75 mL of 1 M MgSO4.
Dauer pheromone plates for dose-response assay	Various		Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 mL of 0.513 M NaCl and 5 µL of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 mL culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H2O to bring the volume to 4.725 mL.  Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 °C. Add 125 µL 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 50 µl 0.1 M CaCl2, 50 µL 0.1 M MgSO4 and 50 µl of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube.  Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).
Microsphere beads 0.1 micron	Polysciences Inc.	00876-15
M9 buffer	Various		Mix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving