Abstract
Células que expresan NG2 (polydendrocytes, células precursoras de oligodendrocitos) son la cuarta población de células gliales importante en el sistema nervioso central. Durante el desarrollo embrionario y postnatal proliferan activamente y generar oligodendrocitos myelinating. Estas células han sido comúnmente estudiado en cultivos primarios de neuronas disociadas, cocultivos, y en tejido fijado. Uso de líneas de ratones transgénicos recientemente disponibles cortan sistemas de cultivo pueden usarse para investigar la proliferación y diferenciación de las células del linaje de oligodendrocitos en ambas regiones de materia gris y blanca del cerebro anterior y el cerebelo. Cultivos de corte se preparan a partir de ratones postnatales tempranas y se mantienen en cultivo hasta por 1 mes. Estos cortes se pueden visualizar varias veces durante el período de cultivo para investigar el comportamiento celular y las interacciones. Este método permite la visualización de la división celular NG2 y los pasos que conducen a la diferenciación de oligodendrocitos al tiempo que permite un análisis detallado de la región-dependenent células NG2 y la heterogeneidad funcional de oligodendrocitos. Esta es una técnica poderosa que se puede utilizar para investigar las señales intrínsecos y extrínsecos que influyen en estas células a través del tiempo en un entorno celular que se asemeja mucho a la que se encuentra in vivo.
Introduction
Cultivos de corte Organoytpic del sistema nervioso central han demostrado ser de gran utilidad para el estudio de las neuronas y la biología de las células gliales en un sistema semiintact 1-4. Estos cultivos son relativamente fáciles de adoptar y mantener muchos beneficios de los cultivos de células disociadas primarios tales como la manipulación del ambiente extracelular y fácil acceso para imágenes de células vivas repetida a largo plazo y los registros electrofisiológicos 5-9. Además, cultivos de cortes de tejido mantienen citoarquitectura 3-dimensional, la conectividad neuronal regional, y la mayoría de tipos de células principales están presentes en el sistema. Estas propiedades hacen que estas culturas un sistema único y conveniente para investigar el comportamiento de una sola célula y fisiología con las interacciones celulares y ambientales.
NG2 células son una población de células gliales en el sistema nervioso central de los mamíferos que continúan proliferando y generar myelinating oligodendrocitos durante el desarrollo embrionario y postnatal 10. Se han estudiado extensivamente en cultivos celulares primarios disociados, y reciente desarrollo de líneas de ratones transgénicos con NG2 expresión específica de célula de proteínas fluorescentes ha facilitado suerte de cartografía vivo y registros electrofisiológicos en preparaciones rebanada agudas en. Incluso con estos estudios, se sabe poco sobre la dinámica temporal de la proliferación celular y la diferenciación de oligodendrocitos NG2. Aunque el cultivo de células disociada es ampliamente utilizado para la instalación relativa en las manipulaciones farmacológicas y genéticas, que no es adecuado para interrogar a diferencias funcionales de estas células en diferentes regiones del cerebro en particular cuando es deseable mantener el contexto de la microambiente celular. Cultivos de cortes proporcionan una alternativa simple que es susceptible de manipulaciones farmacológicas y se han utilizado para investigar la mielinización de oligodendrocitos 11,12, célulaular respuesta después de lisolecitina (LPC) o el anticuerpo induce desmielinización 13,14, y la inducción de remielinización mediante tratamiento farmacológico 15.
Un método para investigar y realizar imágenes en vivo y tejido fijado (o post-fijación) análisis de la proliferación celular y la diferenciación de oligodendrocitos NG2 en cultivos de cortes organotípicos tomadas tanto desde el cerebro anterior y el cerebelo se describe. Este es un poderoso método que se puede utilizar para estudiar el destino celular de las células individuales NG2 después de la división 16 y para descubrir diferencias de región y dependientes de la edad en el factor de crecimiento inducido por la proliferación de células NG2 17. Esta técnica es relativamente simple ampliamente accesible a investigar más a fondo celular intrínseco y / o ambiental mecanismos que regulan la fisiología de estas células gliales y su respuesta a la actividad neuronal o daño de mielina.
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Protocol
NOTA: Todos los animales procedimientos están siguiendo las directrices y han sido aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC) de la Universidad de Connecticut.
NOTA: Para estos experimentos constitutivos NG2cre 18 (JAX # 008533) e inducibles NG2creER 16 (JAX # 008538) ratones transgénicos cruzó a Z / EG 19 (JAX # 003920) o gtRosa26: reportero YFP 20 (JAX # 006148) líneas se utilizaron respectivamente a imagen células NG2 y su progenie. Para imagen oligodendrocitos maduros, se utilizaron ratones transgénicos PLPDsRed 21. Para la supervivencia consistente, rebanadas pueden ser aislados de los ratones hasta el día postnatal 10 tanto desde el cerebro anterior y el cerebelo.
1. Preparación rebanada
- En una campana de cultivo, colocar insertos de cultivo de tejidos en placas de seis pocillos y se añade 1 ml de medio de cultivo de cortes (receta en la sección reactivos). Poner las placas en la incubadora de cultivo celular a 37 ° C con 5% de CO 2 al menos 2 horas antes de la disección.
- Esterilizar todas las herramientas y cortador de tejidos con etanol al 70%.
- Tampón de disección de la burbuja (receta en la sección reactivos) con 95% de O 2, 5% de CO 2 en hielo durante al menos 15 min antes del inicio de la disección.
- Anestesiar crías de ratón, colocándolos en hielo durante 5 a 10 min de acuerdo con los protocolos de los animales aprobados. Determinar la profundidad adecuada de la anestesia mediante la confirmación de que los ratones no responden a la cola y de pellizco del dedo del pie.
- Decapita animales utilizando tijeras afiladas siguientes protocolos de animales. Quite rápidamente el cráneo sobre el cerebro anterior y el cerebelo, haciendo primero un corte sagital seguida de incisión lateral, utilizando herramientas esterilizadas. Cortar los nervios craneales desde la superficie ventral del cerebro y el cerebelo enrollando cuidadosamente el tejido a un lado.
- Coloque el tejido en una placa de 35 mm que contiene tampón de disección estéril oxigenada enfriado con hielo.
- Utilizando una hoja de afeitar, cortar el cerebelo y el cerebro anterior. A continuación, hacer un corte sagital medial throuf el cerebro anterior y el cerebelo, la separación de los hemisferios.
- Cortar 300 micras de espesor secciones coronal y sagital del cerebro anterior y el cerebelo con un cortador de tejidos manual. NOTA: Un cortador de tejidos manual permite un rápido procesamiento de la disección de la incubación de cultivo sin la necesidad de incrustación de agarosa. Un vibratome también se puede utilizar como se describió anteriormente 9.
- Transferir las rebanadas separadas en tampón de disección en frío recién burbujeó en hielo.
- Utilice pequeña disección o con un peso espátulas para separar secciones individuales y transferirlos a preincubada seis pocillos con insertos de cultivo.
- Eliminar cualquier exceso de tampón de la disección de la superficie de la pieza de inserción de cultivo utilizando una pipeta de transferencia desechable o una punta de pipeta P 200. De dos a tres prosencéfalo o tres rebanadas cerebelosas se puede colocar en un inserto de cultivo.
NOTA: Para obtener resultados consistentes con las culturas del cerebro anterior, que es ideal para las rebanadas que abarca el tercio anterior del cuerpo calloso(Figura 1 A) con el fin de estudiar ambas regiones de materia gris y blanca en el mismo segmento. Cada animal por lo general rinde 6 rebanadas del cerebro anterior y 6 rebanadas cerebelo. - Coloque las placas de seis pocillos en la incubadora y reemplazar el medio rebanada con 1 ml de medio rebanada 1 día después de la preparación rebanada y luego cada dos días hasta que la fijación de la rebanada.
- Dependiendo del experimento, utilizar rebanadas después de 5-7 días en cultivo. Utilice únicamente las rebanadas que se convierten en transparentes después de los primeros días y descartar aquellas que tienen regiones opacas irregulares. NOTA: las regiones opacas dentro de rebanadas son visibles a simple vista y aparecen como un grupo de células oscuros bajo contraste de fase. Después de la técnica se ha dominado, rebanadas opacos muertas ocurren rara vez, en menos de 5.1% de las rebanadas.
2. Time-lapse de imágenes de la división de células NG2 y Oligodendrocyte Diferenciación
NOTA: Para realizar la proyección de imagen de lapso de tiempo de la proliferación celular y la diferenciación NG2 utilizamos NG2cre: ratones ZEG 16que expresan EGFP en células NG2 y su progenie (Figura 1C-E). Expresión reportero en esta línea es suficientemente robusto para obtener imágenes en directo de las buenas prácticas agrarias + células en rodajas inmediatamente después de la sección por un período de tiempo de al menos cuatro semanas. Las imágenes más claras se obtienen después del período de adelgazamiento inicial de la rebanada, que se produce durante los primeros 3-5 días en cultivo.
- Durante todo el experimento, mantener las rodajas en un incubador de cultivo celular a 37 ° C y retirar sólo durante breves períodos de tiempo (menos de 15 min por rebanada), manteniendo la tapa en la placa de seis pocillos mientras que las imágenes.
- El uso de un microscopio de fluorescencia invertido equipado con una cámara digital, la captura de imágenes en el primer punto de tiempo utilizando un objetivo de 10X. NOTA: los puntos de primera vez pueden variar por el experimento y puede ser el día en que se prepararon los cortes o cualquier punto de tiempo después.
- Capturar imágenes desde múltiples regiones en el punto de una vez en las dos áreas de materia gris y blanca de la división. Nota ªe región fotografiada por puntos de referencia específicos dentro de la rebanada y mediante la asignación de la ubicación de la imagen en un esquema que puede ser utilizado para las sesiones de formación de imágenes subsiguientes. Puntos de referencia útiles pueden incluir bordes de las rebanadas y / o la orientación de tractos de sustancia blanca. Image siete y cincuenta y seis ubicaciones en cada rebanada en cada punto de tiempo.
- Capturar las imágenes siguientes en un intervalo de 4-6 horas si el examen de la división celular y la diferenciación de oligodendrocitos NG2, idealmente más de 5-7 días.
- Capturar una imagen final de todas las regiones y fijar las rebanadas de inmediato. Añadir 1 ml de fijador (4% PFA con 0,1 M de L-lisina 0,01 M metaperyodato de sodio) a la parte inferior de la inserción del cultivo, a continuación, añadir otros 1 ml en la parte superior de las rebanadas. Tenga cuidado de no rociar el fijador directamente en el segmento, ya que puede desprenderse de la membrana. Fijar el tejido durante 30 minutos y proceder con inmunohistoquímica utilizando marcadores específicos de la etapa de desarrollo, como se describe en la sección 4.
- Rodajas de lavado con tampón fosfato sódico 0,2 M 3 x 10 m. Si es necesario, rebanadas almacena a 4 º C en tampón de fosfato de sodio 0,2 M durante 1-3 días antes de la inmunotinción pero lo ideal es realizar la tinción dentro de las 24 horas. Proceda con la inmunohistoquímica, como se describe a continuación en la sección 4 para determinar la proporción de células que se han diferenciado en oligodendrocitos (Figura 2D-F).
3. Destino Cartografía de la progenie de células NG2 Utilizando ratones Inducible Periodista transgénicos en cultivos de corte
NOTA: Para realizar el seguimiento del destino de las células NG2 desde un punto de tiempo particular en la cultura, NG2creER inducibles: se pueden usar ratones transgénicos YFP.
- Inducir Cre recombinación y expresión del indicador mediante la adición de 100 nM 4OHT disuelto en etanol al medio de cultivo. NOTA: células positivas Reporter deben aparecer dentro de 1-2 días con una eficiencia de inducción de ~ 20-25% YFP células NG2 + + / + NG2 y en este punto el tiempo todo será células en la etapa de células NG2 (Figura 2A-C)
- Fijar y lavar la rebanadas en diferentes puntos temporales después de varias manipulaciones (descritos en las secciones 2.5 y 2.6).
4. rebanada inmunohistoquímica
- Cortar las membranas con las rodajas de adjuntos de los insertos utilizando un bisturí.
- Transferir las rebanadas a pocillos individuales de una placa de 24 solución salina tamponada que contiene bien fosfato (PBS) usando un conjunto de pinzas, teniendo cuidado de no alterar la composición de la rebanada al momento de retirar la membrana.
- Transferencia de las rebanadas a una placa de 24 pocillos con solución de bloqueo que contenía 5% de suero normal de cabra (NGS) y 0,1% de Triton-X100 en PBS durante 1 hr.
- Incubar las rebanadas en anticuerpo primario O / N en un 5% en NGS en PBS a 4 ° C. Para identificar las células en la etapa de células NG2, utilizar anticuerpos contra NG2 y PDGFR. Para la identificación de los oligodendrocitos diferenciados, utilizar un anticuerpo para el antígeno de la poliposis coli adenomatosa (APC; CC1 clon).
- En el segundo día de las rebanadas de lavado en PBS 3 x15 min, luego se incuban en Antibo secundariamuere en 5% de NGS en PBS durante 1 hora a TA. Lávese las rebanadas en PBS 3 x15 min y montar en portaobjetos. Montar con rodajas de arriba y de membrana que se enfrenta la diapositiva para que la membrana no será entre el objetivo y el tejido.
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Representative Results
Se dan ejemplos de datos representativos a continuación que se han obtenido usando cultivos de corte tanto del cerebro anterior y el cerebelo de P8 NG2cre: ZEG, NG2creER: YFP y PLPDsRed líneas de ratones transgénicos. NG2 células se pueden obtener imágenes en día en prosencéfalo y cerebelo rebanadas (Figura 1B-D, video 1) y el fenotipo de estas células se puede determinar después de la fijación y la inmunotinción con anticuerpos CC1 y NG2 (Figura 1E). Además de imágenes en directo, la proliferación celular también se puede evaluar usando tinción inmunohistoquímica para marcadores de proliferación celular tales como Ki67 (Figura 1F). Estos datos permiten el análisis detallado de la dinámica temporal de la diferenciación de oligodendrocitos después de la división celular NG2 sobre una base célula individual. Mapeo de destino de las células NG2 puede llevarse a cabo después de la inducción de la recombinación CRE en rebanadas con 4OHT en NG2creER: YFP ratones (Figura 2). + Células NG2 reportero que expresan YFP fueron found en los cultivos de dos días después de la adición de 4OHT al medio de cultivo (Figura 2A). Seis días después de la inducción 4OHT, una proporción de las células YFP + había diferenciado en CC1 + oligodendrocitos (Figura 2B). Estos datos muestran la viabilidad de ejecutar el mapeo de destino de las células NG2 en rodajas donde el ambiente extracelular pueden ser manipulados para probar los efectos de los agentes farmacológicos o varios insultos en el destino de las células NG2. Diferentes concentraciones de 4OHT pueden ser utilizados para conseguir diferentes grados de recombinación Cre. Por ejemplo, la exposición a 100 nM durante 2 días 4OHT provoca la expresión del indicador en aproximadamente el 20-25% de todas las células que expresan NG2 mientras 1μM 4OHT resulta en aproximadamente 60-70% de eficiencia de recombinación. Finalmente, extensa mielina está presente en estos cultivos y oligodendrocitos mielinizantes se pueden obtener imágenes en rebanadas vivos y fijos utilizando PLPDsRed ratones transgénicos (Figura 3, Vídeo 2).
Figura 1. método de cultivo de la rebanada por formación de imágenes a largo plazo de la proliferación celular y la diferenciación NG2 (AB) esquemático que representa el aislamiento de cerebro anterior y rodajas de cerebelo (A) y posterior cultivo y la imagen de lapso de tiempo utilizando insertos de cultivo de rebanada (B). (C ) Representación delineando la división celular NG2 y posterior diferenciación de oligodendrocitos en NG2cre:. ratones transgénicos zeg (D) Imágenes de ejemplo adquiridas de las regiones corticales de NG2cre: ratones zeg que muestran un solo GFP + células (flechas) que divide dos veces durante un período de 122 h, tiempo representados en la esquina superior derecha como horas después del inicio del experimento de formación de imágenes. (E) La fijación y la inmunotinción con anticuerpos CC1 de la misma rebanada anti-NG2 y revela que la imagen formada Dividicélulas ng resultaron en tres NG2 + células (flechas). (F) Imagen de ejemplo que muestra dos Ki67 + NG2 + células en un cultivo de cortes cortical. (G) Imagen de ejemplo que muestra NG2 + células (puntas de flecha) y sus procesos entrelazados con NeuN + núcleos neuronales en una cortical cultura de corte. Escala Bares 25 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. inducción de la expresión YFP para rastrear el destino de las células NG2 en cultivos de cortes de cerebro anterior (AB) Imágenes tomadas de la región del cuerpo calloso de cultivos de cortes de cerebro anterior de NG2creER: los ratones tratados con YFP 4OHT durante 24 horas y luego a la izquierda en cultivo durante 2 día (A) o 6 días (B) (A) o CC1 y YFP (B) que demuestra la diferenciación de las células NG2 positivos reportero en oligodendrocitos en cultivo, mientras que 6 días después de la recombinación cre (flecha). Escala Bares 25 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. oligodendrocitos Imaging en cultivos de cortes de ratones transgénicos PLPDsRed. (A) Esquema que representa el aislamiento, cultivo y proyección de imagen de rebanadas de cerebelo de ratones transgénicos PLPDsRed. (B) Imagen tomada de una rebanada cerebelo fija después de 5 días in vitro que muestran calbindina + ( cian), las neuronas de Purkinje con mielinizadomielina de los axones básicos proteína + (MBP) (verde) que se proyectan en las regiones de materia blanca de la rebanada. Escala Bar 25 m. (C) Las imágenes de baja magnificación capturados de la misma región cada dos días en los tiempos indicados en horas en cultivos de cortes de cerebelo de ratones PLPDsRed. Barra de Escala 100 micras. Imagen bajo aumento tomado de una cultura de corte PLPDsRed fija que muestra la expresión de MBP en las regiones de materia blanca que se concentran las células DsRed + (D). Bar 100 micras Escala. (E) Imagen de alta magnificación tomada de una cultura de corte PLPDsRed fija que indique DsRed individuales + oligodendrocitos con procesos MBP +. Escala Bar 20 m. (F) Secuencia Time-lapse tomado de una rebanada cerebelo PLPDsRed mostrando cuerpos celulares relativamente estables durante el período de sesiones de formación de imágenes de 48 horas, el tiempo indicado en la parte superior derecha en horas. Escala Bar 25 micras. Pleasí, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Vídeo 1. imágenes en vivo de la división celular NG2 en una cultura rebanada cortical lapso secuencia temporal Representante mostrando múltiples divisiones celulares en una cultura rebanada cortical tomado de un NG2cre:. Ratón transgénico ZEG. Vídeo muestra en 5 fotogramas por segundo, montaje de imágenes que se muestran en la Figura 1. (Ver "Video_1.mov" zona de descargas)
Vídeo 2 imágenes en vivo de los oligodendrocitos en cultivos de cortes de cerebelo Representante lapso-secuencia de tiempo que muestra pequeños cambios en la morfología de los oligodendrocitos (flecha) fotografiado más de 48 horas en una rebanada cerebelo tomado de un ratón transgénico PLPDsRed. Vídeo muestra en 3 fotogramas por segundo, montaje de imágenes que se muestran en la Figura 3. (Ver "Video_2.mov" zona de descargas)
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Discussion
La mielinización en el sistema nervioso central es esencial para la comunicación eficiente neuronal y la supervivencia axonal 22. Células NG2 generan continuamente oligodendrocitos myelinating en la edad adulta, mientras que el mantenimiento de una población residente en la mayoría de las regiones del cerebro 16,23 - 25. Algunos de los mecanismos genéticos y moleculares que regulan la diferenciación de estas células han sido descritas, pero mucho queda por descubrir. Cultivos de cortes organotípicos son una herramienta conveniente para investigar estos mecanismos, debido a sus características únicas de mantenimiento de regiones anatómicas, fácil manipulación del medio ambiente extracelular, robusto mielinización, y la presencia de todos los principales tipos de células. Estas características facilitan la investigación de las interacciones de corto y largo plazo entre las células, los oligodendrocitos y los axones 11,26 NG2. Además, el trasplante de células es relativamente fácil de realizar y se puede utilizar para investigar región dependiente de dL as diferencias en el comportamiento celular 17. Además, los tratamientos farmacológicos se pueden añadir al medio de cultivo para investigar los mecanismos moleculares que influyen en la proliferación de células NG2 y / o diferenciación normales en 17,27,28 y culturas desmielinizadas 15,29. Finalmente, es técnicamente factible el uso de cultivos de cortes a realizar pantallas para análisis de alto rendimiento de compuestos que dirigen las células NG2 a proliferar o diferenciar, posiblemente, incluso después de un insulto desmielinizante 30.
Los métodos actuales para investigar las células del linaje de oligodendrocitos y sus interacciones con los axones en un entorno controlado cultura incluyen co-cultivos con disociada ganglio de la raíz dorsal (DRG) o las neuronas corticales embrionarias y las células NG2 31,32, que se basaban en las preparaciones originales desarrolladas para investigar DRG celular -Schwann Interacciones de 33. Estos cultivos se han utilizado para investigar las propiedades fundamentales de axón y oligodendrocitosinteracciones de células del linaje incluida la señalización dependiente de la actividad para inducir la diferenciación neuronal y la producción de mielina 32,34 - 36, además de otras cuestiones tales como la dependencia de diámetro del axón y la densidad de células NG2 proliferación de control y el inicio de la diferenciación 37. Si bien estos sistemas de cocultivo son ideales para hacer frente a este tipo de preguntas, correlación directa y la aplicación a la situación in vivo no siempre es clara. Como se mencionó anteriormente, los cultivos de cortes organotípicos proporcionan una condición única de mantener muchas de las conexiones neuronales locales y tres citoarquitectura dimensional que se pierden en los preparativos de co-cultivo de células disociadas. Además a diferencia de los cultivos de cortes organotípicos, sistemas de co-cultivo de células disociadas a menudo no incluyen otras células gliales y las moléculas de la matriz extracelular que han demostrado que juegan un papel clave en el desarrollo, el mantenimiento y la fisiología de las células NG2, oligodendrocitos, Y la mielina. Con el dramático crecimiento en la variedad de herramientas disponibles para el etiquetado y la manipulación de las poblaciones de células diferenciadas con vectores virales y animales transgénicos, la imagen a largo plazo y suerte de cartografía en cultivos de cortes organotípicos específica debe llegar a ser una poderosa técnica para la investigación de células NG2 proliferación, diferenciación y mielinización de oligodendrocitos.
Varios pasos críticos deben llevarse a cabo al realizar estos experimentos para asegurar la supervivencia de la rebanada y la reproducibilidad de los datos. En primer lugar, con el fin de generar las rebanadas sanos, seccionar y el aislamiento de las rebanadas deben realizarse lo más rápidamente posible y, en tampón de disección en frío de hielo. En segundo lugar, mientras que la adquisición automatizada posición de la imagen con una platina motorizada en el microscopio de fluorescencia puede ser útil, hay muchos factores que pueden alterar la reubicación precisa de las regiones con imagen y adquisición Manual repetida es necesario para obtener imágenes consistentemente confiables sobre multiple día. Esto es particularmente necesario si las rodajas se mantienen en una incubadora de cultivo celular entre las sesiones de formación de imágenes y no en una incubadora de etapa superior. En tercer lugar, durante la fijación rebanada, tinción y montaje es extremadamente importante para manejar las rodajas suavemente como cualquier alteración del tejido dará lugar a la incapacidad para reubicar regiones y las células fotografiadas en vivo. No hay modificaciones específicas de los métodos tradicionales de cultivo de cortes de preparaciones que se utilizan para los estudios de neuronas y astrocitos.
Hay varias limitaciones para el método de cultivo de cortes que se debe considerar. Los astrocitos, microglia y células NG2 se sabe que responden al daño del SNC con aumento de la proliferación en el sitio de la lesión y la formación de una cicatriz glial. El proceso de preparación de las rebanadas resultados en cierta reorganización y una respuesta glial reactivo inicial de estas células. NG2 tasas de proliferación de células vuelven a niveles similares a los reportados en vivo para emparejadoetapas de desarrollo después de varios días en cultivo sin embargo el aumento de las tasas de proliferación y fenotipo reactiva inicial de estas células deben ser considerados en la interpretación de los datos. La presencia de suero de caballo en el medio de cultivo podría alterar la proliferación de células NG2 y se debe considerar al interpretar los resultados de cualquier experimento. Además de esto, mientras que hay actividad neuronal espontánea, la entrada sensorial y las conexiones entre las neuronas de largo alcance se carece, lo que podría conducir a la actividad neuronal alterada dentro de la rebanada. Finalmente, sin el uso de promotor impulsado vectores virales específicos o ratones transgénicos, las manipulaciones genéticas tipo de células específicas dentro de los sistemas de cultivo de rebanada es un reto. Si bien estas limitaciones deben ser considerados en el diseño de los experimentos, los cultivos de cortes son un sistema único que se puede utilizar para obtener una idea de la novela preguntas que no pueden responderse con cultivos de células disociadas o en el animal intacto.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slice Culture Medium | |||
| Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11090 | 50% |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175 | 25% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | 25mM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 1mM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 1mg/L |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 0.4mM |
| Horse Serum | Hyclone | SH30074.03 | 25% |
| Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius | |||
| Dissection Buffer | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 124mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.004mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | 1.25mM |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M7506 | 4.004mM |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 2mM |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | 26mM |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | 10mM |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 2.0mM |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | 0.075mM |
| Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use | |||
| Other Reagents and Supplies | |||
| 4-hydroxy tamoxifen (4OHT) | Sigma-Aldrich | H7904 | 100nM |
| Paraformaldehyde (PFA) | EM Sciences | 19200 | 4% |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L-6027 | 0.1M |
| Sodium Metaperiodate | Sigma-Aldrich | S-1878 | 0.01M |
| Rabbit anti NG2 antibody | Chemicon (Millipore) | AB5320 | 1:500 |
| Mouse anti CC1 antibody | Calbiochem (Millipore) | OP80 | 1:200 |
| Mouse anti Ki67 antibody | Vision Biosystems | NCL-Ki67-MM1 | 1:300 |
| Mouse anti NeuN antibody | Chemicon (Millipore) | MAB377 | 1:500 |
| Species specific secondary antibodies | Jackson Immunoresearch | ||
| Normal Goat Serum (NGS) | 5% | ||
| Triton X-100 | 0.10% | ||
| Mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size | Fisher Scientific | PICM03050 | |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Ethanol | |||
| 95% O2 5% CO2 gas mix | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| Sterile six well plates | |||
| Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas | |||
| Manual or automatic tissue chopper | |||
| Razor blades | |||
| Disposable transfer pipettes | |||
| 35mm and 60mm sterile Petri dishes | |||
| Stereomicroscope | |||
| Inverted Phase Microscope | |||
| Laminar Flow Hood | |||
| Tissue Culture Incubator | |||
| Inverted Fluorescence Microcope | |||
References
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