שיטה חדשה של תרופות אמריקניות לדג הזברה מרובה (<em> Rerio Danio</em>) וכימות של נסיגה
Summary
A novel method for reducing variability when exposing fish to drugs is explained. Fish exposed to various patterns of ethanol exposure were found to have altered anxiety levels during withdrawal in a light/dark scototaxic assay.
Abstract
Anxiety testing in zebrafish is often studied in combination with the application of pharmacological substances. In these studies, fish are routinely netted and transported between home aquaria and dosing tanks. In order to enhance the ease of compound administration, a novel method for transferring fish between tanks for drug administration was developed. Inserts that are designed for spawning were used to transfer groups of fish into the drug solution, allowing accurate dosing of all fish in the group. This increases the precision and efficiency of dosing, which becomes very important in long schedules of repeated drug administration. We implemented this procedure for use in a study examining the behavior of zebrafish in the light/dark test after administering ethanol with differing 21 day schedules. In fish exposed to daily-moderate amounts of alcohol there was a significant difference in location preference after 2 days of withdrawal when compared to the control group. However, a significant difference in location preference in a group exposed to weekly-binge administration was not observed.
This protocol can be generalized for use with all types of compounds that are water-soluble and may be used in any situation when the behavior of fish during or after long schedules of drug administration is being examined. The light/dark test is also a valuable method of assessing withdrawal-induced changes in anxiety.
Introduction
דג הזברה (Danio rerio) הוא בעלי חוליות קטנים שמקורו בהודו שהוא אורגניזם מודל שימושי עבור 2,3 מחקר התנהגותי 1 והרפואי. דג הזברה גם משמש בבדיקות של חומרים תרופתיים שונים על מנת לאפיין את השפעתן על התנהגות. מינונים ולוחות זמנים של מתן תרופה שונים שימשו כדי לחקור את ההתנהגות של דג הזברה לאחר מתן תרכובות הכימי כגון חומרים ממריצים 4, anxiolytics 5 ואתנול 6-8.
המעבדה שלנו חקרה את ההשפעות של שונה לוחות זמנים של ממשל אתנול על חרדה ותנועת דג הזברה באור / חושך assay תוקף היטב 9, 20, גם המכונה גם assay scototaxic. שיטה חדשה של ממשל אתנול פותחה כדי להגביר את היעילות עבור ממשל חוזר ונשנה, מדי יום במשך תקופה ארוכה של זמן (21 ימים) 6 </sעד>. שיטות ששמשו בעבר היו מעשיות, לעומת זאת, ביקשנו לפתח שיטה שצמצמה רשת, עם עלויות הזמן הקשורים אליו, ואפשרו ממשל בו זמנית, בעיתוי המדויק של התרופה של עניין למספרים גדולים של דגים. באתנול מחקר באמצעות מסורתי, דג הזברה הם נלכדו ברשת והועברה מטנק אחד למשנה המכיל את התערובת המתאימה של אתנול ומים 10-12. למרות ששיטה זו היא מקובלת מאוד, רשתות דג הזברה עשויה להגדיל את השונות בזמן שנדרש כדי להציג ולהסיר את הדגים מהפתרון התרופתי. לכן, החשיפה המדויקת למתחם של עניין עשויה להשתנות במהלך ניסוי מעורב מינון חוזר ונשנה. שיטה שמפחיתה מקורות שגיאה הנובעת מהשתנות בזמני תחבורה לכן רצויה. בשיטה שלנו אנו מסוגלים להעביר את כל הדגים בו זמנית, וכתוצאה מכך זמן מינון זהה בכל דגים. בעקבות חשיפת אתנול (שתוארה כאן), דג הזברה יכולה להיבדק בכל number של מבחני התנהגות, כוללים אלה שלהעריך חרדה. יש מינון קבוצות של דגים בשיטה החדשה שימושים מעשיים מעבר ליכולת לשכפל במדויק ולתקן מינון בין נושאים ובין קבוצות של דגים. כניסתו של תוכנה חדשה המאפשרת למעקב של דגים מרובים בבת אחת יכול לראות חוקרים להשתמש בשיטות שלנו כדי להבטיח replicability ודיוק בניסויים שלהם. בהתחשב בשימוש הנרחב בדג הזברה כאורגניזם מודל למדעי מוח ההתנהגותיים, שיטה זו תגביר את היעילות ומעשיות במחקרים פרמקולוגיים עתיד.
בפרדיגמה הנוכחית, לוח הזמנים של מינון חוזר ונשנה הועסקו כי כ משקף לוחות זמנים שתיית אדם. דגים חולקו באופן אקראי לאחת משלוש קבוצות: שליטה, יומי-מתונה, או שבועי בולמוס. לוח הזמנים של המינון היה 21 ימים בזמן, נבחר משום שהוא חרג באופן משמעותי זמני חשיפה במחקרים קודמים 7. דגי בקרה קיבלו אפס Alcoחול, דגים מדי יום-מתונים קיבלו 0.2% אלכוהול פעם ביום, ודגים שבועי בולמוס קיבלו 1.4% אלכוהול פעם בשבוע. משימת האור / החושך שימשה להערכת חרדה אחרי 2 ימים של נסיגה. זוהי בדיקה פשוטה יחסית לניהול המשתמש בזירה מלבנית שבה הקירות בצד אחד הם לבנים ובצד האחר הם 9 כהים. דג הזברה מבוגרת וחסונה מעדיפה את הצד האפל של הזירה בתנאי שליטה 6,9,13. חרדה מוגברת מוגדרת מבצעית כמו יותר זמן באופן משמעותי בילה באזור החשוך, וירידה בחרדה ניתן להניח כאשר הדגים מבלה את הזמן יחסית יותר בילה באזור האור. עם תוכנת תנועת מעקב, יכולים להיות גם לכמת משתנים אינפורמטיבי אחרים, כולל מהירות ממוצעת, חוסר תנועה, מתפתל, ואזור מעברים 14.
שיטת המינון שפותחה במעבדה שלנו יכולה לחול על כל מחקר שבו תרכובות מסיסים במים מנוהלות לzebrafi אחד או יותרsh. סוכנים תרופתיים רבים אחרים אשר עשוי להפיק תועלת ממתודולוגיה זו כרגע נבחנו בדג זברה. תרכובות שנבדקו בדרך כלל כוללות ניקוטין, chlordiazepoxide, buspirone, וscopolamine, אשר מומס באופן דומה לאתנול; על ידי ערבוב את הכמות המתאימה של החומר הכימי לתוך מים. לכן, ההיקף הכללי של הליך זה הוא הרבה יותר רחב ולא מוגבל לאתנול. יתר על כן, לאחר מינון עם תרופות למספר ימים, משימת האור / חושך היא רק אחד ממבחנים התנהגותיים רבים שיכולים להיות מועסק. לאחר מתן תרופה או במהלך נסיגה, מבחני פופולריים אחרים שניתן לנצלם יכללו את בדיקת טנק רומן צלילת 15 ובדיקות של התנהגות חברתית כגון shoaling 16. ההליך הבא מתאר שיטה יעילה להעברה שוב ושוב קבוצות של דגים או דגים בודדים לפתרונות המכילים תרכובת תרופתית של עניין. בנוסף, התהליך של חרדת בדיקה במבחן האור / החושךבקבוצות של דגים שנמצאים בנסיגה לאחר שנחשף ללוחות זמנים של ממשל אלכוהול ארוכים יתואר.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקרים קודמים הכוללים מתן תרופה בדג זברה פשוט הסתמכו על קיזוז דגים להעביר אותם מהטנק בביתם לפתרון התרופתי 12,16. בנוטינג לא תמיד עולה בקנה אחד ולעתים לוקח יותר זמן מהצפוי עקב תגובת הבריחה של דג הזברה, שבו יש השתנות אישית משמעותית. שיטות העברה מסורתיות, בעוד שימושי…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Three Shelf benchtop housing system | Aquatic Habitats | N/A | http://aquatichabitats.com/research-systems/z-hab-system/ |
| 1.5L Spawning tank w/400 micron baffle | Aquatic Habitats | N/A | http://aquatichabitats.com/consumables/tanks-lids-and-baffles/info/nursery-tank-and-baffles/ |
| Pure Grain Ethanol | Luxco, INC | N/A | http://www.luxco.com/public/brands/brands.asp?brandid=21 |
| Ethovision XT Motion tracking software | Noldus Information Technology | http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt | |
| Pipette | Eppendorf Canada | http://www.eppendorf.ca/int/index.php?l=211&pb=e396f9e705e754a3&action=products&contentid=1&catalognode=9477. | |
| Light/Dark Arena | Custom | Construct as per procedure description. 9.5cm wide, 9.5cm deep, 55cm long |
Riferimenti
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biological Reviews. 83 (1), 13-34 (2008).
- Langheinrich, U. Zebrafish: A new model on the pharmaceutical catwalk. BioEssays. 25 (9), 904-912 (2003).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Miller, N., Greene, K., Dydinski, A., Gerlai, R. Effects of nicotine and alcohol on zebrafish ( Danio rerio) shoaling. Behavioural brain research. , (2012).
- Bencan, Z., Sledge, D., Levin, E. D. Buspirone, chlordiazepoxide and diazepam effects in a zebrafish model of anxiety. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 94 (1), 75-80 (2009).
- Holcombe, A., Howorko, A., Powell, R. A., Schalomon, M., Hamilton, T. J. Reversed Scototaxis during Withdrawal after Daily-Moderate, but Not Weekly-Binge Administration of Ethanol in Zebrafish. PLoS ONE. 8 (5), (2013).
- Mathur, P., Guo, S. Differences of acute versus chronic ethanol exposure on anxiety-like behavioral responses in zebrafish. Behavioural Brain Research. 219 (2), 234-239 (2011).
- Dlugos, C., Rabin, R. Ethanol effects on three strains of zebrafish: model system for genetic investigations. Pharmacology Biochemistry and Behavior. , (2003).
- Maximino, C., et al. Scototaxis as anxiety-like behavior in fish. Nature Protocols. 5 (2), 209-216 (2010).
- Gerlai, R., Lee, V., Blaser, R. Effects of acute and chronic ethanol exposure on the behavior of adult zebrafish (Danio rerio). Pharmacology Biochemistry and Behavior. 85 (4), 752-761 (2006).
- Egan, R. J., et al. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behavioural brain research. 205 (1), 38-44 (2009).
- Gebauer, D. L., et al. Effects of anxiolytics in zebrafish: Similarities and differences between benzodiazepines, buspirone and ethanol. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 99 (3), 480-486 (2011).
- Serra, M. C., Mattioli, R. Natural preference of zebrafish (Danio rerio) for a dark environment. Braz J Med Biol Res. 32 (12), 1551-1553 (1999).
- Maximino, C., et al. Behavioral and neurochemical changes in the zebrafish leopard strain. Genes Brain Behav. 12 (5), 576-582 (2013).
- Levin, E. D., Bencan, Z., Cerutti, D. T. Anxiolytic effects of nicotine in zebrafish. Physiology & Behavior. 90 (1), 54-58 (2007).
- Gerlai, R., Chatterjee, D., Pereira, T., Sawashima, T., Krishnannair, R. Acute and chronic alcohol dose: population differences in behavior and neurochemistry of zebrafish. Genes, Brain and Behavior. 8 (6), 586-599 (2009).
- Mathur, P., Berberoglu, M. A., Guo, S. Preference for ethanol in zebrafish following a single exposure. Behavioural Brain Research. 217 (1), 128-133 (2011).
- Renninger, S. L., et al. Investigating the genetics of visual processing, function and behaviour in zebrafish. Neurogenetics. 12, 97-116 (2011).
- Crawshaw, L. I., et al. Tolerance and withdrawal in goldfish exposed to ethanol. Physiology & Behaviour. 87 (3), 460-468 (2006).
- Hamilton, T. J., Holcombe, A. Tresguerres, M.CO2-induced ocean acidification increases anxiety in rockfish via alteration of GABAA receptor functioning. Proceedings of the Royal Society B. , (2014).
- Ramsay, J. M., Feist, G. W., Varga, Z. M., Westerfield, M., Kent, M. L., Schreck, C. B. Whole-body cortisol response of zebrafish to acute net handling stress. Aquaculture. 297 (1-4), 157-164 (2009).
- Hamilton, T. J., Paz-Yepes, J., Morrison, R. A., Palenik, B., Tresguerres, M. Exposure to bloom-like concentrations of two marine Synechococcus cyanobacteria (strains CC9311 and CC9902) differentially alters fish behaviour. Conservation Physiology. 2 (1), (2014).
