Introduction
العقدية الرئوية، وهي المستعمر المشترك للمجتمع متعدد المكروبات من البلعوم الأنفي، غير قادرة على المنافسة مع الآخرين، والمكورات الرئوية وثيقي الصلة من خلال إنتاج الببتيدات المضادة للميكروبات أنتجت البكتريا (bacteriocins). كل سلالة المكورات الرئوية التسلسل بالكامل بحثت حتى الآن يحتوي على نسخة من ب acteriocin- ل آيك ص eptide موضع، BLP. وقد تجلى إنتاج مبيد جرثومي من المكورات الرئوية إلى أن تكون مهمة في نتائج سواء في المختبر وفي الجسم الحي المنافسة 1-4. وتتأثر ديناميكية تنافسية من خلال التعبير عن bacteriocins المتنوعة جنبا إلى جنب مع البروتينات الحصانة وما شابه ذلك ردا على الببتيد فرمون محددة. يتم التحكم تحريض موضع BLP عن طريق نظام الاستشعار عن النصاب فيه فرمون الببتيد، BlpC، بربط كيناز الاستشعار، BlpH، ويبدأ شلال يشير مما أدى إلىالنسخ من موضع 5،6 BLP. هناك أربعة اختلافات أليلية من BlpC أن كل مأزق لBlpH المشابهة لها 6. للخلية من أجل البقاء آثار مبيد جرثومي الخاص بها، ونسخه الجينات التي تشفر البروتينات الحصانة وما شابه ذلك على نفس الاوبرون حيث أن كل من الجينات مبيد جرثومي. يحدث إذا قتل سلالة منافس غير قادر على upregulate موضع BLP ردا على فرمون خارجي أو، إذا كان يفتقر إلى سلالة الجين الحصانة معين المطلوبة للحماية. مجمع نقل، مطلوب BlpAB عن إفراز وتجهيز فرمون الببتيد والببتيدات مبيد جرثومي 2،4. في الآونة الأخيرة، فقد تبين أن نسبة كبيرة من سلالات المكورات الرئوية هي "الغشاشون" يعني لديهم طفرة في الجين الحفظ blpA مما يجعلها غير قادرة على إفراز الفيرمونات وbacteriocins 1،2. هذه السلالات هي قادرة على الاستجابة لBlpC خارجية المنشأ 2 يفرزها صهيلسلالات مملة السماح لإنتاج البروتينات الحصانة.
وعلى الرغم من الاستعدادات الخام من bacteriocins من supernatants يمكن إعداد من سلالات منتج باستخدام أساليب الخطوات البيوكيميائية لتحقيق النقاء، وهذا النهج ليس مفيدا لفحص مجموعات كبيرة من العزلات وإذا كان مستوى التعبير مبيد جرثومي منخفضة في مرق نمت الثقافات 2،7- 9. يستخدم الفحص تراكب كوسيلة سريعة للتحقيق في الديناميات التنافسية بين السلالات التي قد تكون موجودة في المختبر. للقيام بذلك، سلالة المكورات الرئوية هو على لوحة آغار وسمح لتنمو لتحقيق تركيزات البكتيرية محلية كافية لتحريض موضع BLP تلقيح مسبقا. ثم يتم تلقيح سلالة الثاني في حل أجار لينة المنصهر التي يتم بعد ذلك تطبيقها على سلالة تلقيح قبل لاختبار حساسية. لتقييم لنشاط موضع BLP (مستقلة عن النشاط المثبطة)، سلالات يمكن مضافين مع سلسلة من عشرالعناصر الأرضية النادرة التي سبق وصفها سلالات مراسل BlpC. شيدت هذه السلالات لاحتواء واحد من ثلاثة blpH الأليلات المختلفة التي تستجيب لالفيرومونات BlpC الثلاثة الأكثر شيوعا التي يفرزها المكورات الرئوية. سلالات مراسل لها الجين lacZ المتكاملة التي هي تحت سيطرة المروج يعتمد BlpH وتحمل الحذف في الجينات blpC يمنع التحفيز الذاتي 10،11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد منتج سلالة
- خط سلالة المكورات الرئوية لفحصها لإنتاج مبيد جرثومي على 5٪ الأغنام الدم الصويا زيتية لوحة أجار من -80 ° C الأسهم الفريزر.
ملاحظة: استخدام لوحات الدم للنمو الأولي من سلالة لفحصها لتثبيط يزيد كثيرا من استنساخ للمقايسة. بالإضافة إلى ذلك، وغيرها من السلالات غير الرئوية التي تنتج bacteriocins يمكن استخدامها على الرغم من أن قد تحتاج إلى تعديل لكائن معين ظروف النمو. وقد استخدمنا العقدية الهينة وLactococcus اللبنية في مقايسة تراكب بنجاح. - احتضان لوحة بين عشية وضحاها (O / N) عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
- بعد مرور فترة الحضانة من سلالة منتج، وإعداد زيتية أجار الصويا (TSA) لوحة من قبل pipetting 3،000 إلى 4،000 وحدة من الكاتلاز على لوحات تحتوي على 25 مل من TSA ونشر الحل الكاتلاز باستخدام الخرز الزجاجي معقمة. السماح لوحة جافة لمدة 10 دقيقة تحتخزانة السلامة البيولوجية.
- جمع كمية مرئية من البكتيريا على طرف ماصة. طعن غيض ماصة في لوحة TSA المجففة.
ملاحظة: أكثر من سلالة واحدة منتج ويمكن طعن في لوحة واحدة TSA. من المهم أن الفضاء خارج طعنات بحيث الناتجة هالات لا تتداخل.- إذا كان ذلك ممكنا، وتشمل يعرف مبيد جرثومي منتج كعنصر تحكم إيجابية والسلالة لاستخدامها في تراكب كعنصر تحكم السلبية.
ملاحظة: الضوابط الإيجابية والسلبية هي تم نشرها سابقا ومتاحة عند الطلب 10.
- إذا كان ذلك ممكنا، وتشمل يعرف مبيد جرثومي منتج كعنصر تحكم إيجابية والسلالة لاستخدامها في تراكب كعنصر تحكم السلبية.
- احتضان TSA وحة تحتوي طعنات متعددة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 6 ساعة.
2. جعل الأسهم الجلسرين من سلالة تراكب
- إعداد مخزونات الجلسرين (ثقافات نمت إلى مرحلة منتصف الأسي ثم تخزينها في -80 درجة مئوية بعد إضافة الجلسرين) قبل يوم من الفحص تراكب. تطعيم 5-10 مستعمرات شارع المكورات الرئويةعين لفحصها للحساسية أو إفراز فرمون تود هيويت في المتوسط 0.5٪ مع مستخلص الخميرة (THY).
ملاحظة: بناء BlpC صحفيين محرض وقد وصفت سابقا 2 و هم سلالات متاحة عند الطلب. - احتضان 5-10 المستعمرات في أنابيب زجاجية مع 5 مل من THY مع الأغطية مغلقة بإحكام في 37 ° C حمام الماء دون أن تهتز.
- احتضان الثقافات في 37 درجة مئوية حتى التوصل الى OD 620 من 0،3-0،5.
ملاحظة: هذا سوف يستغرق حوالي 4-5 ساعة اعتمادا على السلالة المستخدمة.- عكس بلطف الأنبوب عدة مرات قبل قياس OD.
- إذا كانت التجربة لا يمكن أن يؤديها في نفس اليوم أو سيتم استخدام سلالة عدة مرات في المستقبل، وجعل الأسهم الجلسرين واستئناف التجربة في وقت لاحق. للأسهم الجلسرين، إضافة الجلسرين على الثقافات إلى تركيز النهائي من 20٪. الثقافات قسامة إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -80 درجة مئوية. ملاحظة: يمكن أن تكون عينات قtored لشهور في -80 درجة مئوية. إن لم يكن جعل الأسهم الجلسرين، واستخدام عينات للفحص مباشرة تراكب.
3. تراكب الفحص
- قبيل تراكب التطبيق، خلط مكونات تراكب. في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، إضافة 5 مل من THY، 3،000-4،000 U من الكاتلاز، و 200 ميكرولتر من ثقافة مرق سلالة تراكب التي كانت إما نمت ذلك اليوم أو الأسهم الجلسرين من الثقافة التي تم إذابة في درجة حرارة الغرفة. إذا باستخدام سلالة المراسل، إضافة 50 ميكرولتر من X-غال (40 ملغ / مل) إلى الخليط تراكب. استخدام أنبوب مخروطي واحد لكل لوحة.
- تتوازن مزيج تراكب في درجة حرارة الغرفة قبل إضافة المنصهر TSA.
- إزالة لوحة TSA مع سلالة طعن من الحاضنة. تذوب الصلبة TSA في الميكروويف والحفاظ في 55 ° C حمام الماء حتى جاهزة للاستخدام. إضافة 3 مل من المنصهر TSA مع 1.5٪ أجار تبرد إلى 55 درجة مئوية إلى تراكب الخليط.
- إعداد مزيج تراكب مباشرة قبل pipetting ل، ستبدأ الخليط إلى ترسيخ جدابسرعة. ملاحظة: إذا يبدأ تراكب لترسيخ قبل الطلاء، فإن النتائج ستكون uninterpretable.
- مزج الخليط تراكب بواسطة pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات مع 5 مل الماصة والحرص على عدم إدخال فقاعات في الخليط. ماصة ببطء خليط تراكب مباشرة على لوحة TSA طعن. إبقاء لوحة على الفوق لبضع دقائق مما يسمح للأجار لتتصلب.
- لا تدوير لوحة لتوزيع الخليط تراكب، وهذا سيسحب من نمو ثقافة طعن في تراكب.
- وضع بعناية TSA وحة مع تراكب في الحاضنة 37 درجة مئوية تحتوي على 5٪ CO 2 O / N (حوالي 16-18 ساعة).
- مراقبة لوحات بعد نمو بين عشية وضحاها. يجب أن تظهر لوحات مبهمة من النمو من سلالة تراكب إلا في المناطق التي حدث تثبيط أو فرمون إشارات. سوف تظهر هذه كمناطق إما واضحة أو الزرقاء حول سلالة طعن، على التوالي.
ملاحظة: على الرغم من أن قياس آثافةيمكن تحديد تظهر عناصر من القطر من المقاصة زرقاء أو التقييم الكمي، والاختلافات في القطر ويمكن أيضا أن تختلف تبعا لكمية البكتيريا التي طعن في لوحة. الفحص تراكب هو فحص نوعي، ينبغي تفسير أي تقييم كمي بحذر. يعتبر أي المقاصة واضحة بالمقارنة مع سيطرة سلبية والنشاط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هناك نوعان من النتائج المحتملة في مقايسة تراكب. يجب أن يكون من الممكن أن نرى النمو من سلالة طعن بعد الحضانة بين عشية وضحاها. في الشكل 1A، سلالة تراكب حساس لbacteriocins التي يتم إنتاجها. منطقة التخليص يمكن تصور المحيطة سلالة طعن. بالإضافة إلى ذلك، دوامات من سلالة طعن في مزيج تراكب ممكنة، ويمكن مشاهدته في الشكل 1A. في الشكل 1B، سلالة تراكب هو في مأمن من bacteriocins يجري يفرز كما لاحظ غياب هالة المحيطة طعنة. ومن الممكن أيضا أن سلالة طعن لا إفراز bacteriocins. لفحص الإشارات، وهما نتائج مختلفة ممكنة. سلالة طعن قادر على إفراز فرمون أن يتفاعل مع كيناز الحامض الاميني من سلالة تراكب، كما رأينا من خلال انهيار X-غال كما هو مبين في الشكل 2A. إذا لم يتم تنشيط فرمون النسخ لل موضع BLP في سلالة المراسل، أو إذا كانت سلالة طعن لا تفرز فرمون، لن يحدث انهيار X-غال كما هو مبين في الشكل 2B.
الرقم 1. المظهر من BLP بوساطة تثبيط والحصانة في مقايسة تراكب. (A) سلالة P133، وقد ارتفعت منتج مبيد جرثومي في لوحة TSA وسمح لتنمو لمدة 6 ساعة. تم تلقيح P250 سلالة، سلالة سلبي مبيد جرثومي، إلى تراكب. صورت لوحات بعد O / N الحضانة. وأشار منطقة التخليص بالسهم. وقد ارتفعت (B) سلالة P133 في لوحة TSA وحضنت لمدة 6 ساعة. سلالة 130، التي تحتوي على طفرة انزياح الإطار في blpA، تم تلقيح في تراكب. بعد O / N الحضانة، صورت لوحات.
الصفحة = "دائما"> 
الشكل 2. فرمون بوساطة تفعيل موضع BLP في الإشارة فحص. (A) P133 الانفعال، وهو نوع BlpC R6 secretor، وقد ارتفعت في لوحة TSA وحضنت لمدة 6 ساعة. P981 السلالة، وهو نوع BlpC مراسل R6 مع الحذف في BlpC، تم تلقيح في تراكب. وقد أخذت الصور بعد O / N الحضانة. وقد ارتفعت (B) P133 في لوحة TSA. بعد مرور فترة الحضانة لمدة 6 ساعة، P845، وهو مراسل BlpC نوع P164 مع الحذف في BlpC، تم تلقيح في تراكب. وقد أخذت الصور بعد O / N النمو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا الاختبار تراكب هو وسيلة سريعة لتحديد نطاق النشاط للمنتجين مبيد جرثومي وإظهار التفاعلات التنافسية التي قد تحدث بين سلالات المكورات الرئوية. الفحص تراكب يمكن تكييفها لاستخدامها لفحص سلالات متعددة لإنتاج مبيد جرثومي على لوحة واحدة. قمنا بنجاح فحص مجموعات سلالة كبيرة مع هذا الاختبار باستخدام المكرر 48 دبوس إلى تطعيم لوحات SBA من نصف واحد من لوحة 96 جيدا. بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها، يتم تحويل النمو إلى لوحة TSA باستخدام المكرر واختراق سطح أغار من لوحة مع دبابيس من المكرر.
كما يمكن فحص الببتيدات المضادة للميكروبات أخرى تفرز البكتريا التي تنظم بطريقة تعتمد الكثافة مثل lantibiotics باستخدام تقنية تراكب 7،12،13. وهذا مفيد خصوصا عندما تنقية من مبيد جرثومي أو lantibiotic صعبة. على الرغم من supernatants يمكن اختبار لمضادات الميكروباتالنشاط، تعبيرا عن bacteriocins BLP المستمدة في مرق محدودة جدا أو غير موجود (لا تظهر البيانات). الفحص تراكب يسمح للنمو لأعلى كثافة الذي لا يتحقق عندما تزرع الكائنات في السائل. قد تعكس أيضا النمو على وسط صلب أكثر عن كثب ظروف النمو في الجسم الحي من البلعوم الأنفي.
ويمكن أيضا فحص تراكب استخدامها لفحص قدرة سلالة طعن علي إفراز فرمون إشارات مبيد جرثومي محدد. وهذا يتطلب بناء سلالة المراسل الذي يعبر عن البروتين مستقبلات فرمون والذي يتم وضع فرمون المروج استجابة المنبع من الجين lacZ. التقدير من إفراز فرمون عن سلالة طعن هو مفيدة بشكل خاص حيث قراءات النشاط موضع BLP إذا سلالة طعن لا تمنع سلالة تراكب. عدم القدرة على كبح سلالة تراكب يمكن أن يكون نتيجة لموضع BLP غير وظيفية (مثل فيتوتر مع طفرة نقل) أو لأن bacteriocins يفرز ليست فعالة ضد السلالة تراكب معين اختبارها. يوفر تراكب سلالة مراسل معلومات إضافية موضع في المنتج لديه تعمل بكامل طاقتها نقل اثنين من نظام مكون وBlpA السماح للupregulation وإفراز فرمون. هذا يعني أن أي bacteriocins المشفرة تفرز أيضا.
هناك بعض القيود لهذا الاختبار. الفحص تراكب هو فحص نوعي، لذلك مقارنات بين النشاط المثبطة أو إفراز فرمون من سلالات مختلفة يجب أن تتم بعناية. وينبغي النظر في معدلات النمو والظروف عند مقارنة سلالات مختلفة لأن نتائج الفحص تعتمد بشكل كبير على معدل نمو تراكب وسلالات طعن. إضافة الكاتلاز إلى كل لوحة وتراكب مهمة من أجل إزالة الآثار المثبطة من المكورات الرئوية H 2 O 2 الإنتاج علىالنمو من سلالة تراكب، وبخاصة عند استخدام الكاتلاز كائن سلبي في التراكب. نظرا لتنوع المحتوى الجيني المعروف من السكان في المكورات الرئوية، أي نشاط المثبطة شهدت مع هذا الاختبار لا يمكن أن يعزى تلقائيا إلى موضع BLP دون تحليل deletional.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH2O autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH2O autoclave |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
References
- Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo. Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).
- Sawa, N., et al. Isolation and characterization of enterocin W, a novel two-peptide lantibiotic produced by Enterococcus faecalis NKR-4-1. Appl Environ Microbiol. 78 (3), 900-903 (2012).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195 (7), 1561-1572 (2013).
- Lux, T., Nuhn, M., Hakenbeck, R., Reichmann, P. Diversity of bacteriocins and activity spectrum in Streptococcus pneumoniae. J Bacteriol. 189 (21), 7741-7751 (2007).
- Reichmann, P., Hakenbeck, R. Allelic variation in a peptide-inducible two-component system of Streptococcus pneumoniae. FEMS Microbiol Lett. 190 (2), 231-236 (2000).
- Saizieu, A., et al. Microarray-based identification of a novel Streptococcus pneumoniae regulon controlled by an autoinduced peptide. J Bacteriol. 182 (17), 4696-4703 (2000).
- Barbour, A., Philip, K., Muniandy, S. Enhanced production, purification, characterization and mechanism of action of salivaricin 9 lantibiotic produced by Streptococcus salivarius NU10. PLoS One. 8 (10), 77751 (2013).
- Wladyka, B., et al. Isolation, biochemical characterization, and cloning of a bacteriocin from the poultry-associated Staphylococcus aureus strain CH-91. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (16), 7229-7239 (2013).
- Shea, E. F., et al. Bactofencin a, a new type of cationic bacteriocin with unusual immunity. 4 (6), 00498-00413 (2013).
- Son, M. R., et al. Conserved mutations in the pneumococcal bacteriocin transporter gene, blpA, result in a complex population consisting of producers and cheaters. MBio. 2 (5), (2011).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195, 1561-1572 (2013).
- Widdick, D. A., et al. Cloning and engineering of the cinnamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 4316-4321 (2003).
- Begley, M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Identification of a novel two-peptide lantibiotic, lichenicidin, following rational genome mining for LanM proteins. Appl Environ Microbiol. 75 (17), 5451-5460 (2009).
