형질 전환의 세대<em> 히드라</em> 배아 미세 주입에 의해

Summary

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Abstract

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology¹. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Introduction

히드라 재생, 패턴 형성을 연구하고, 약 250년 ^2에 대한 줄기 세포에 사용 된 히드라 세 세포 계보로 구성된 간단한 몸 계획이 있습니다. 외배엽 상피, 내배엽 상피와 간질을. 관형 본체는 하나의 셀 층 각각 외배엽과 내배엽 상피 계통에 의해 형성된다. 신체 열에있는 상피 세포의 유사 분열 모두이다. 상피 세포가 사지 ^3으로 변위되는 경우, 반구 끝에 경구 단부 또는 피트 (기저 디스크)에서 헤드 (입과 촉수), 이들은 세포주기의 G2 단계에서 체포 세포 운명 ^{4 변경.} 간질 혈통의 세포는 상피 세포 사이의 간극 내에 상주. 이 계보는 몸의 열 ^다섯의 외배엽 상피 층에있는 다 능성 줄기 세포에 의해 지원됩니다. 격자 간 줄기 세포는 체세포 세 CEL을 야기리터 유형 (신경, 동맥 세포 및 nematocytes)와 생식 세포 ^6,7.

분류학상의 문 자포의 일원으로서, 모든 bilaterians에 자매 그룹은 히드라는 다세포 동물에서 공유 근본적인 생물학적 과정에 빛을 발산 할 수 있습니다. 최근까지, 이러한 노력은 유전자 기능의 신뢰성 섭동 방법의 부족에 의해 방해 하였다. 그러나, 형질 전환 방법 ^(1)의 발전과 함께, 이제 이러한 줄기 세포 기능, 재생, 및 패터닝과 같은 다세포 동물에 공통의 기본 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 히드라 충분히 활용할 수있다. 형질 전환 하이 드라 라인은 새끼의 상당한 주파수에서 임의의 통합과 키메라 식 결과 배아에 플라스미드 DNA의 주입에 의해 설정됩니다. 특정 계보에 균일 한 표정으로 라인이 무성 전파에 의해 설립 될 수있다. clonally transg을 전파 할 수있는 능력enic 히드라 라인은 유성 생식에 의해 전파 될 수있는 동물 모델의 대다수 위에 장점이다. 또한, 형질 전환 된 세포를 동물에 의한 투명도 및 내인성 형광 단백질 ^(8)의 부재로 생체 내에서 용이하게 추적 할 수있다.

제 형질 히드라 라인 보낸 7 년 같은 라인이 다양한 애플리케이션에 사용되어, ^하나 만들었다. 상이한 세포 유형에서 형광 단백질의 발현이 가능 세포의 움직임을 추적하는 세포 모양의 변화를 관찰하고, 야생형 조건에서 화학적 섭동 ^1,5,9-12 후 두 세포의 운명을 추적했다. 또한, 다양한 다른 계통의 형광 단백질의 발현은 특정 세포 집단의 FACS 분리 가능하다. 이 기술은 줄기 세포 고유의 mRNA와 혈통 고유의 작은 RNA를 ^{13, 14의} 순서 사용되어왔다. 발기인의 동안이 히드라 액틴 유전자 중 하나는 가장 널리 사용되고 몇몇 세포 타입 특이 적 프로모터는 형질 전환 식별 히드라 ^{9,11,15,16에서} GFP의 발현을 구동하기 위해 사용되어왔다. 미래에, 셀 타입 특이 적 프로모터는 특정 세포 유형의 관찰 및 수집을 허용한다. 또한, 형질 전환 방법은 성공적 Wnt3 촉진제 ^(17)의 시스 – 작용 조절 요소를 정의하는 데 사용 하였다.

히드라 형질 전환 방법의 개발은 이소성 발현, 과다 발현 및 넉다운하여 유전자의 기능을 테스트하기위한 강력한 접근 방식을 제공한다. 형질 전환 동물은 기능 및 셀룰러 지역화 ^18-20 모두를 조사하기 위하여 형광 표지 된 단백질을 발현하는되었습니다. 또한, GFP 형질 전환 유전자의 3'UTR에 헤어핀 RNA의 발현은 표적 유전자의 녹다운 ^{(21, 22)로} 이끈다. 이러한 방식에서 GFP는 식별하기 위해 필요하다및 형질 전환 라인의 작성 중에 유전자 변형 조직을 추적 할 수 있습니다. 그러나, 일부 경우에 GFP 분자 태그 단백질의 기능을 방해 할 가능성이있다. 최근의 연구는 히드라 유전자가 오페론 구조로 배열 될 수 있다는 것을 보여줍니다, 즉 polycistronic 성적 증명서는 트랜스 – 스 플라이 싱 리더 첨가하여 분리하고 별도로 ²³ 번역하는, 만들어집니다. 단백질 또는 오페론 및 하류 위치에 형광 단백질 유전자의 상류 위치에서 RNA의 머리핀을 코딩하는 유전자를 배치함으로써, 하나의 단백질 또는 RNA 머리핀을 코딩하는 유전자를 태그하지 않고 유전자 변형 조직을 추적 할 수있다. 이 방법은 ^유전자를 넉다운 ¹⁴ 달성하기 위해 DsRed2와 오페론 구성 머리핀 RNA를 발현하기 위해 사용되어왔다.

Protocol

플라스미드 DNA, 바늘, 및 사출 식기 1 준비 전용선 또는 맥시 미디 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 제조하고 ML 에탄올 침전을 사용하여 / 2.5 mg의 DNA를 집중한다. DNA 펠렛 클레아없는 탈 이온수에 용해한다. -20 ° C에서 10 ~ 20 ㎕의 분취 량의 DNA를 저장합니다. (가능한 벡터의리스트 보충 표 1 참조) 100 × 15mm 페트리 접시에 배아를 유지하기위한 저점을 구성하는 아가 로?…

Representative Results

형질 전환 하이 드라 라인 구축 아테 미아 노 플리 우스와 함께 2-3 일마다 형질 전환 새끼 피드. 부화 한 새끼는 때때로 부화 후 하루나 이틀 동안 먹지 않는다. 일부 새 새끼는 살아남지 못할 것이다, 따라서 식사를하지 않으며, 않습니다. 갓 부화가 외배엽 (그림 1A) 중 하나의 형질 전환 또는 내배엽 상피 조직의 경우, 동물이 꽃 봉오리 가장 형질 전환…

Discussion

히드라는 정기적으로 무성하게 재현하지만, 생산 배우자를 시작합니다 환경 자극을 필요로한다. 이러한 자극은 대부분의 하이 드라 종에 대해 잘 정의되지 않고 변형에 변형과 다를 수 있습니다. 성적인 될 히드라을 유도 실험실 환경에서 어려울 수 있기 때문에 형질 히드라의 생산에 상당한 장애물 정기적 배아를 획득한다. AEP 균주 ^{25 그러나,} 실험실에서 쉽게…

Materials

AEP Hydra Strain	NA	NA	Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp
High Speed Maxi Kit	Qiagen	12662
100 x 15 mm Petri Dishes	BD Falcon	351029
75 x 50 mm Glass Microscope Slide	Sigma	CLS294775X50
Microinjection Fish Mold	IBI Scientific	FM-600
Borosilicate Glass with Filament	Sutter Instrument	BF100-50-10	O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Phenol Red	Sigma	P3532
Jewelers Forceps, Durmont #5	Sigma	F6521
Scalpel Blade #15	Fisher	50-822-421
Mineral oil	Sigma	M8410-500ML
Microinjector	Narishige	IM-9B
Magnetic Stand	Narishige	GJ-1
Iron Plate	Narishige	IP
Joystick Micromanipulator	Narishige	MN-151