トランスジェニックの世代<em>ハイドラ</em>胚マイクロインジェクションによる
Summary
Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.
Abstract
As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.
Introduction
Hydraは再生、パターン形成を研究し、約250年2のための幹細胞に使用されているHydraは 3つの細胞系統からなるシンプルなボディープランがあります。外胚葉上皮、内胚葉上皮と間質を。管状体は、単一の細胞層でそれぞれが外胚葉と内胚葉上皮系統によって形成される。体内の欄の上皮細胞のすべてが有糸分裂である。上皮細胞は、尾方端に経口端部または足に四肢3、ヘッド（口および触手）（基礎円板）に変位するとき、それらは、細胞周期のG2期で停止させると、細胞の運命4を変更する。間質細胞系統の細胞は、上皮細胞間の隙間内に存在する。この系統は、本体コラム5の外胚葉上皮層に位置している多能性幹細胞でサポートされています。間質幹細胞を3セルの体細胞を生じさせるLタイプ（神経、腺細胞、およびnematocytes）と生殖細胞6,7。
門刺胞動物、すべてbilateriansの姉妹グループの一員として、Hydraは多細胞動物の間で共有の基本的な生物学的プロセスに光を当てることができます。最近まで、これらの努力は、遺伝子機能の摂動のための信頼できる方法の欠如により妨げられた。しかし、トランスジェニック手法1の開発を、私たちは今、幹細胞機能、再生、およびパターニングなどの多細胞動物に共通する基本的なメカニズムのよりよい理解を得るためにハイドラを最大限に活用することができます。トランスジェニックヒドララインは、孵化のかなりの頻度でランダムな組み込みおよびキメラ発現をもたらす胚へのプラスミドDNAの注射によって確立される。特定の系列に均一発現とラインが無性繁殖によって確立することができる。クローン的transgを増殖させる能力ENIC ヒドララインは、有性生殖により増殖することができる動物モデルの大部分よりも有利で ある。また、トランスジェニック細胞は、動物の透明性および内因性蛍光タンパク質8が存在しない場合にインビボで容易に追跡することができる。
第一のトランスジェニックヒドラ線が1行われたので、7年間、そのような線は、さまざまな用途に使用されてきた。異なる細胞型における蛍光タンパク質の発現は、細胞の動きを追跡する細胞形状の変化を観察し、野生型条件および化学的摂動1,5,9-12後の両方において細胞の運命を追跡することが可能となった。また、さまざまな系統の異なる蛍光タンパク質の発現は、特定の細胞集団のFACS単離を可能にする。この技術は、幹細胞特異的mRNAおよび系統特異的低分子RNA 13,14の配列決定のために使用されてきた。プロモーターの一方2 ヒドラアクチン遺伝子の一つは、最も広く使用されているいくつかの細胞型特異的プロモーターを同定し、トランスジェニックヒドラ 9,11,15,16でGFPの発現を駆動するために使用されている。将来的には、細胞型特異的プロモーターは、任意の特定の細胞型の観察および回収を可能にする。また、トランスジェニックアプローチは、成功しWnt3をプロモーター17のシス作用調節エレメントを定義するために使用された。
ハイドラにおけるトランスジェニック方法の開発が異所性発現、過剰発現、およびノックダウンにより遺伝子の機能をテストするための堅牢なアプローチを提供します。トランスジェニック動物は、機能および細胞局在18-20の両方を検討するために、蛍光標識タンパク質を発現することが行われている。また、GFP導入遺伝子の3'UTR中のRNAヘアピンの発現は、標的遺伝子21,22のノックダウンにつながる。これらのアプローチでは、GFPを識別するために必要とされているトランスジェニックラインの作成中にトランスジェニック組織を追跡します。しかしながら、いくつかのケースではGFP分子は、タグ付きタンパク質の機能を妨害する可能性がある。最近の研究では、 イドラ遺伝子がオペロン構成に配置することができることを実証する、 すなわち、多シストロン性転写物はその後、トランス-スプライスリーダーを添加することにより分離し、個別に23翻訳される、作製される。タンパク質またはオペロンと下流位置における蛍光タンパク質遺伝子の上流位置でヘアピンRNAをコードする遺伝子を配置することによって、人は、タンパク質またはRNAヘアピンをコードする遺伝子をタグ付けすることなく、トランスジェニック組織を追跡することができる。この方法は、14遺伝子ノックダウンを達成するためにDsRed2のとオペロン構成のRNAヘアピンを発現するために使用されてきた。
Protocol
Representative Results
Discussion
Hydraは日常的に無性再現しますが、配偶子の生産を開始する環境刺激を必要とします。これらの刺激はほとんどハイドラ種について、明確に定義されておらず、歪み歪みと異なる場合があります。それは性的になるためにハイドラを誘導するために実験室の設定で困難な場合がありますので、トランスジェニックハイドラの生産に重要なハードルは定期的に胚を得?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、HLにG.ハロルド＆レイラY.マザーズ賞でサポートされているとRESCEJにNIHの助成金（R24 GM080527）はNRSA博士研究員（NIH F32GM9037222）され、現在国立からの指導研究員開発賞でサポートされていた老化に関する研究所（K01AG04435）。私たちは、有益なコメントを頂いた査読に感謝したいと思います。
Materials
| AEP Hydra Strain | NA | NA | Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp |
| High Speed Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| 100 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351029 | |
| 75 x 50 mm Glass Microscope Slide | Sigma | CLS294775X50 | |
| Microinjection Fish Mold | IBI Scientific | FM-600 | |
| Borosilicate Glass with Filament | Sutter Instrument | BF100-50-10 | O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Phenol Red | Sigma | P3532 | |
| Jewelers Forceps, Durmont #5 | Sigma | F6521 | |
| Scalpel Blade #15 | Fisher | 50-822-421 | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-500ML | |
| Microinjector | Narishige | IM-9B | |
| Magnetic Stand | Narishige | GJ-1 | |
| Iron Plate | Narishige | IP | |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 |
Riferimenti
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