En radio-telemetri system til overvågning Kardiovaskulær funktion i rotter med Spinal Cord transection og embryonale neural stamcelle transplantater

Summary

Vi præsenterer en protokol for at bruge en radio-telemetrisk system til registrering kardiovaskulære parametre i T4 rygmarv overskårne rotter otte uger efter det embryonale hjernestammen neural stamcelle podning i læsionsstedet. Telemetri er en avanceret teknik til præcist at vurdere den kardiovaskulære funktion i bevidste frit bevægelige rygmarvsskadede rotter.

Abstract

Høj thorax eller cervikal rygmarvsskade (SCI) kan føre til hjerte-kar-dysfunktion. Til overvågning kardiovaskulære parametre, vi implanteret et kateter forbundet til en radiosender i den femorale arterie i rotter, der undergik en T4 rygmarven overskæring med eller uden podning af embryonale hjernestamme-afledte neurale stamceller, der udtrykker grønt fluorescerende protein. Sammenlignet med andre metoder såsom kanyleindføringsdel eller hale-manchet, telemetri er fordelagtig til løbende at overvåge blodtryk og hjertefrekvens i frit bevægelige dyr. Det er også i stand til langsigtede flere opkøb data. I rygmarvsskadede rotter lykkedes registreret basale kardiovaskulære data i henhold til uhæmmet tilstand og autonom dysrefleksi som reaktion på kolorektal udspiling. Derudover kan kardiovaskulære parametre før og efter SCI sammenlignes i samme rotte, hvis en sender implanteres før rygmarv overskæring. En begrænsning af den beskrevne telemetRy procedure er, at implantation i den femorale arterie kan påvirke blodforsyningen til den ipsilaterale bagben.

Introduction

Kardiovaskulær dysfunktion opstår efter rygmarvsskade (SCI) på et højt niveau. Det manifesterer sig i uordnede blodtryk og puls i hvile, ortostatisk hypotension, anstrengelsesudløst hypotension og autonom dysrefleksi karakteriseret ved episoder af hypertension og baroreflex-medieret bradykardi som reaktion på sensoriske stimuli under skaden niveau ^1,2. Disse symptomer forstyrre dagligdagen for rygmarvsskadede patienter. Derfor er det vigtigt at etablere effektive redskaber til undersøgelse af kardiovaskulære ændringer i dyr med SCI og eksperimentelle behandlinger.

At undersøge kardiovaskulære funktion i dyr, er adskillige teknikker blevet anvendt til at overvåge blodtryk og hjertefrekvens. Centrale kardiovaskulære parametre kan registreres af kanyleindføringsdel og telemetri, mens invasive hale-manchetter kan anvendes til at måle perifert blodtryk ^3. Sammenlignet med andre metoder, teleMetry har den største fordel, at det giver mulighed for kontinuerlig optagelse i frit bevægelige dyr og langsigtet overvågning af hjerte-kar-funktion ^4. I SCI dyremodeller, kan ændringerne i perifert blodtryk efter eksperimentel stimulation ikke være stor nok til at blive opdaget. Derfor bør vælges passende hjertemonitorering teknik til dyr med SCI.

I den foreliggende undersøgelse blev en radio-telemetri, der blev indført for at overvåge hjerte-kar-funktion hos voksne rotter efter komplet rygmarv transection. Rotter modtog transplantater af syngene rotte embryonal dag 14 (E14) hjernestamme-afledte neurale stamceller (BS-NSC) i læsionsstedet. Rotter med skade og ingen transplantation og naive, uskadt rotter tjente som kontroller. Proceduren telemetri omfatter senderen sterilisering og implantation (figur 1), registrering af basal kardiovaskulær parameter colorektale distension-inducerede reaktioner og senderen rengøring ogopbevaring.

Protocol

Alle dyr protokoller blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC). NIH retningslinjer for forsøgsdyr, pleje og sikkerhed er strengt følges. Dyr med kirurgiske procedurer er blevet tilstrækkeligt behandlet for at minimere smerte og ubehag.

1. rygmarv Curgery og Cell Podning

1. Autoklave kirurgiske instrumenter forud for alle operationer. Brug Hot Bead Sterilizer (Fine Science Tools) til at fjerne patogener og mikrobielle forureninger fra instrumenter mellem procedurer på forskellige dyr. Brug sterile kirurgiske handsker, kjole, og gardiner under operationen. Ansæt aseptisk kirurgisk teknik til hver kirurgisk procedure.
2. Bedøver kvindelige Fischer 344 rotter med en kombination (2 ml / kg) af ketamin (25 mg / ml), xylazin (1,3 mg / ml) og acepromazin (0,25 mg / ml) administreret via intraperitoneal injektion (ip).
3. Barbere området tilbage og rense huden gentagne gange med Betadine og ethanol.
4. Skær huden ved hjælp af en # 10 klinge og ligeud dissekere muskler lag. Brug en skalpel til at isolere hvirvlerne, udsætte T3 ryghvirvel og udføre en dorsal laminektomi med en fin spids Rongeurs.
5. Incise dura langs og transektere rygmarven på T4 niveau ved hjælp af en kombination af iridectomy saks og microaspiration at skabe en rostrocaudal hul ca 1 mm mellem rygsøjlens træstubbe.
6. Vent omkring 1 - 2 min, indtil blødningen helt stopper, derefter suturer muskler med 3-0 Vycril og lukke huden med sårklemmer.
7. Injicer Ringer-laktat (5 ml), buprenorphin (0,035 mg / kg), og ampicillin (33 mg / kg) subkutant umiddelbart efter operationen og opretholde rotter i en varm inkubator indtil vågen.
8. Injicer Ringers og Ampicillin opløsning en gang daglig i op til 10 dage, og buprenorphin to gange dagligt i 3 dage, eller indtil tegn på smerte og lidelse forsvinde. Må ikke returnere et dyr til selskab med andre dyr, inden fUlly inddrives.
9. Tømmes manuelt blæren to gange om dagen for omkring to uger, indtil etableringen af ​​refleks blære tømning, og derefter tømme blæren en gang om dagen i hele at overleve, hvis det er nødvendigt.
10. To uger senere, re-bedøver SCI rotter som beskrevet ovenfor og igen udsætte rygmarven læsionsstedet. Hold dura lukket at fastholde implanterede celler i læsionsstedet.
11. Der injiceres 10 pi celle-opløsning (3,5 × 10 ⁵ ul), indsamles fra E14 allestedsnærværende GFP transgene rotteembryoer og indlejret i fibrinogen og thrombin ^5,6, i epicentret af læsionen hulrum og rostral og kaudal grænseflade læsion med multipel injektion steder, ved hjælp af en trak glas mikropipette med en indvendig diameter på 40 um, som er forbundet til en Hamilton-sprøjte.
12. Suturere muskellagene og lukke huden med sårklemmer.
13. Udfør postoperativt indsprøjtning og blære pleje som beskrevet i trin 1,6-1,8.
14. En uge væreforgrunden perfusion injicere 0,5% Fluorogold (FG, 0,4 ml i destilleret vand) intraperitonealt til retrograd label sympatiske præganglioniske neuroner i rygmarven ^7.

2. Transmitter Implantation

1. Soak transmittersin 2% glutaraldehydopløsning (4 ml 50% glutaraldhyde i 96 ml destilleret vand) i mindst 1-2 timer (op til 10 timer) ved stuetemperatur til sterilisering.
2. Vask sendere grundigt med sterilt 0,9% saltvand 3 gange og gemme dem i saltvand indtil brug (ikke mere end 1 time).
3. Otte uger efter E14-celle transplantation (10 uger efter skade), reanesthetize rotterne der undergik en lokalitet med eller uden celle podning og naive kontrol rotter.
4. Barbere maveregionen og bagben. Rens huden med Betadine. Placer rotte på operationsbordet i rygleje.
5. Incise huden på den ventrale abdomen og indvendige lår på højre side ved hjælp af en # 15 blad.
6. Skær gennem Subcutaneous bindevæv at eksponere bundt af femorale skibe og nerve med en lille saks.
7. Adskil femoralarterien fra venen og nerve med en fin pincet med buede spidser.
8. Put tre silkesuturer under arterien og gøre en løs knude i hver sutur.
9. Anvend 0,1 ml lidocain (2%) til overfladen af ​​arterien til fremkaldelse af vasodilatation til efterfølgende kateterisation.
10. Fastgør fartøjet distalt med en permanent silke knude og midlertidig blok proximalt ved at strække en løs silkesutur.
11. Punktering arterien under anvendelse af en 20 gauge buet nål og spidsen af ​​afstandsmåler kateter (8 cm lang) under anvendelse af et kateter indføring værktøj.
12. Sæt kateteret rostrally op til 4 cm og derved placere spidsen i thorax aorta.
13. Forankre katetret inden i beholderen ved at binde tre silkesuturer rundt lårarterien.
14. Lav en subkutan lomme langs flanken mellem caudale kant af brystkasse og than mest kranielle udvidelse af knæet sortiment med en stump saks.
15. Sæt senderen kroppen ind i lommen og suturen bindevævet omkring senderen for at undgå overdreven bevægelse.
16. Suturere huden med nr 6 silketråd.
17. Injicer Ringer-laktat (5 ml), buprenorphin (0,035 mg / kg), og ampicillin (33 mg / kg) subkutant umiddelbart efter operationen og opretholde rotter i en varm inkubator indtil vågen.

3. Basal gennemsnitligt arterietryk (MAP) og hjertefrekvens (HR) Optagelse

1. Så tidligt som én dag efter senderen implantation, sætte et enkelt dyr på modtageren pad og tænde for senderen. Vent i omkring 10 - 15 min til vænne dyret og stabilisere kardiovaskulære parametre.
2. Optag hvilende MAP og HR, som er afledt fra impulsgeneratoren arterielle tryk med et edb-dataopsamlingssystem for mindst 1 time. Indsamle data hvert 5 sek.
3. Overvåg endyr, løbende og fjerne datapunkter i forekomsten af ​​synlige spasmer. For hvert dyr, til de gennemsnitlige datapunkter opnå middelværdier.

4. Colorectal udspiling-induceret autonom dysrefleksi

1. Begrænse NSC podede eller SCI kontrol rotter i et håndklæde leveres med foderpiller inde på transmitteren modtager. Normalt rotter kan bo samarbejdsvilligt under proceduren.
2. Indsæt en latex ballon spids kateter i rektum i ca 2 cm og fastgør den til halen med tape ^8.
3. Tænd for senderen og vent 10 - 15 minutter at lade blodtrykket til at vende tilbage til forud for indsætning baseline.
4. Fremkald colorektal udspiling ved oppustning af ballonen langsomt over 10 sek med 1,4 ml luft i 1 min, for at generere et tryk på cirka 30 mm Hg.
5. Optag MAP og HR 1 min før, 1 min under og 1 min efter kolorektal udspiling; prøve data hver 3 sek under 3 min procedure.
6. Udfør 2 - 3 forsøg per dyr med mindst 15 min opsving interval mellem to forsøg.
7. Overdosering dyr (ip) med dobbelt dosis anæstesi kombination beskrevet ovenfor, hvis ikke yderligere evaluering. Perfundere dyr med saltvand efterfulgt af 4% paraformaldehyd.
8. For hvert dyr gennemsnittet af værdierne før og under kolorektal udspiling henholdsvis; beregne forskellen mellem baseline og udspiling-induceret MAP og HR ændringer for hvert forsøg; gennemsnit over de 2 - 3 forsøg på at opnå middelværdier.

5. Transmitter Rengøring

1. Fjern senderen fra dyrekroppen efter anæstesi, men før perfusion. Soak straks i et bæger fyldt med destilleret vand, indtil rengøring; undgå udtørring af afstandsmåler enhed.
2. Overfør afstandsmåler til 1% Terg-A-Zyme enzymatisk rengøringsmiddel (10 g / l vand) i 24 timer ved stuetemperatur.
3. Regel spidsen af ​​senderen kateter med en stump 30 gauge nålforbundet til usually sprøjten.
4. Tør forsigtigt senderen ved hjælp af en foldet blødt væv og gemme det i den oprindelige plastbakke.

Representative Results

Anvendelse af den ovenfor beskrevne telemetri teknik, vi med succes optaget kardiovaskulære parametre i rygmarvsskadede dyr. Hos dyr med SCI alene, blev det flerårige væsentligt reduceret hvorimod HR øget i forhold til naive dyr, i overensstemmelse med tidligere rapporter ^9. Hos dyr med BS-NSC podning, MAP og HR nærmede niveauer, der måles i naive dyr (Figur 2). Under kolorektal udspiling blev en rotte betragtet som dysreflexic hvis skadelige stimulation produceret en stigning i MAP og et fald i HR ^3,8. Episodisk hypertension og baroreflex-medierede bradykardi uundgåeligt udløst i alle dyrene, men i hvilket omfang afveg mellem grupperne. KORT stigning i dyr podet med BS-NSC var meget lavere (16,9 ± 3,1 mm Hg, n = 3) end dyr med skade alene (64,1 ± 1,6 mm Hg, n = 3) (figur 3). Men faldet i HR i kolorektal udspiling ikke afviger betydeligt mellem gruppesek. Som bradykardi medieres af baroreflex mekanismer, kan denne uoverensstemmelse skyldes nedsat følsomhed af baroreceptors efter SCI ^10. Krampe forekom i colorektal udspiling i de fleste rotter uanset behandlingen.

Ved histologisk analyse, immunolabeling indikeret fremragende transplantat overlevelse i rygmarv implanteret med BS-NSC men et hul i rygmarven af ​​sårede kontroldyr uden graft. Føtal NSC helt fyldt læsionsstedet og kun mindre hulrum blev observeret. Implantater integreret i værtslandet grå og hvid substans både rostrally og kaudalt. Der blev fundet et stort antal TH ⁺ catecholaminerge og 5-HT ⁺ serotonerge neuroner i BS-NSC implantater, og mange axoner topografisk innerveret caudale sympatiske præganglioniske neuroner i intermediolaterale celle kolonne over lange afstande (Figur 4). I modsætning hertil tilskadekomne dyr uden graft, TH ⁺ / 5-HT ⁺ fibers blev ikke fundet i thoracolumbale rygmarv under læsionen (ikke vist).

Figur 1:. Diagram kateterisering af den femorale arterie Den femorale arterie (A.) dissekeres fra nerven (N.) og vene (V.) og derefter punkteres med en buet nål. Kateteret er forbundet til senderen er indsat i arterien, placere spidsen af ​​kateteret på niveau med den torakale aorta for kardiovaskulær optagelse (~ 4 cm).

Figur 2: Basal MAP og HR komme i rygmarvsskadede rotter podet med BS-NSC I et repræsentativt kohorte (n = 3 / gruppe), telemetri optagelse viser signifikant lavere basal MAP og højere HR i rotter med SCI og ingen behandling 10 wee. ks efter skade (* p <0,05). I modsætning hertil både kardiovaskulære parametre komme til niveauet for naive rotter 8 uger efter BS-NSC podning (10 uger efter skaden) (begge p> 0,05; ANOVA efterfulgt af Fishers post hoc).

Figur 3: Colorectal distension (CRD) -induceret autonom dysreflexic Autonome dysrefleksi udløses under en 1 min CRD i både SCI og BS-NSC podede dyr, manifesterer sig som episodisk hypertension ledsaget af bradykardi.. (A) i en skadet kontrol rotte, MAP stiger med cirka 60 mmHg under kolon udspiling. (B) Stigningen af MAP kraftigt reduceret til 10 - 20 mmHg i en rotte podet med BS-NSC.

14 / 51914fig4highres.jpg "/>
Figur 4: Grafted BS-NSC integration i modtagerlandet voksen rygmarv og differentiere til catecholaminerge og serotonerge neuroner (A) Otte uger efter BS-NSC podning, GFP og GFAP dobbelt immunolabeling demonstrerer fyldning af læsionen site med implanterede GFP mærkede celler i. et langsgående rygmarv sektion. (B) I modsætning hertil findes et hul i en transected rygmarv uden graft. (C, D) immunmærkning for tyrosinhydroxylase (TH) og serotonin (5-HT) afslører mange TH og 5-HT-positive neuroner i transplantatet. (E, F) Graft-afledte TH ⁺ og 5-HT ⁺ axoner udvide og innerverer caudale sympatiske præganglioniske neuroner mærket med Fluorogold i intermediolaterale celle kolonne. Skalapanelerne: 1 mm (B) 25 um (D) og 50 m (F).

Discussion

Traditionelt er en væskefyldt kanyle indsat i arterien og forbindes til en tryktransducer til at optage kardiovaskulære parametre som en terminal snapshot i hvert dyr ^11. Til kontinuerligt at overvåge hjerte-kar ydeevne i lang tid, er radio-telemetri systemer anvendes i mange laboratorier. Denne mere raffineret værktøj kan optage blodtrykket i bevidst, frit bevægelige dyr. Sammenlignet med væskefyldte katetre er telemetri betragtes som en mere avanceret teknik til præcist at vurdere kardiovaskulær funktion i SCI dyr. Selv om der i den foreliggende undersøgelse en transmitter blev implanteret kun 1 dag før optagelse, kan det implanteres før eller efter SCI for erhvervelse af flere data, afhængigt af de eksperimentelle betingelser ^12. For basal blodtryk og HR, enten central eller perifer optagelse kan opnås. Dog kan kardiovaskulær reaktion på kolorektal udspiling ikke påvises ved invasiv hale-manchet-baserede metode ivores erfaring. Seneste telemetrisk analyse verificeret langsigtet vedvarende hypotension og takykardi efter fuldstændig høj thorax rygmarv transection hos rotter ^9,13. Den lavere basale MAP og højere HR i vores SCI kontrol rotter er i overensstemmelse med foregående rapport ved hjælp af samme optagelse teknik. Colorectal-induceret autonom dysrefleksi blev lindret hos rotter, der modtog celle graft. Baseret på vores histologiske tegn, catecholaminerge og serotonerge input til SPN'er tværs af flere spinal segmenter kan redegøre for de fysiologiske forbedringer.

Transmitter kateterisation er afgørende for en vellykket implantation og optagelse. I rygmarven overskårne rotter diameter femorale arterie er mindre end sædvanligt på grund af mangel på motorisk og sensorisk funktion af baglemmer. Fuldstændig lammelse normalt resulterer i muskelsvind. Kirurger kan finde spidsen af ​​katetret til at være større end arterien. I dette tilfælde anvender 2% lidocain påoverflade af arterien fremkalde vasodilation tillader spidsen af ​​kateteret let kan indsættes i de punkterede fartøjer. Især fortsætter lidocain induceret vasodilatation ca. 4 - 5 min. Således bør fartøj punktur og kateterisation udføres så hurtigt som muligt. I perioden for erhvervelse af basale parametre data vi indsamlede datapunkter hver 5 sek i 1 time. Under 3 min kolorektal udspiling-induceret optagelse imidlertid data blev udtaget hver 3 sek for at opnå flere datapunkter for en mere præcis gennemsnit i hele denne korte periode.

Implantation af et kateter i den femorale arterie kan forstyrre blodforsyningen af ​​bagbenet og inducere vævsnekrose, især hvis den distale arterie sutureres. Tætning kateteret indsætningspunktet ind i arterien med en lille dråbe vævslim stedet for en silkesutur mindste delvist kan genoprette blodstrømmen. Derved vil dyrene være sundere for langsigtet overvågning.Alternativt kan kateteret i senderen implanteres direkte ind i den abdominale aorta placere transmitteren organ i bughulen. Denne metode undgår væv henfald i den ipsilaterale bagben, men har en risiko for at påvirke gastrointestinal funktion.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibrinogen (rat)	Sigma	F6755-25MG	2 hr at 37 oC to dissovle
Thrombin (rat)	Sigma	T5772-100UN	Dissovle in 10 mM CaCl2
1% Terg-A-Zyme	Sigma	Z273287	Enzymatic solution for telemeter cleaning
Fluorogold	Fluorochrome		Dissovle in distilled water and avoid light
Telemeter            (PA-C40)	Data Sciences International
Telementric recording and analysis system	Data Sciences International		Signal stimulator, Data Exchange Matrix, receivers, Ambient pressure reference monitor
Balloon-tipped catheter	Edward Lifesciences	111F7-P	For colorectal distension