생성<em> 엔테로 박터</em> SP. YSU 영양 요구는 트랜스포존 돌연변이 유발을 사용하여
Summary
엔테로 박터 SP. YSU는 포도당 최소 염 배지에서 성장한다. 영양 요구 임의로 숙주 게놈 내로 그 자체를 삽입 transposome로 변환함으로써 생성된다. 돌연변이는 최소 배지에 복잡한 매체로부터 복제 도금에 의해 발견된다. 중단 된 유전자는 유전자 구조 및 시퀀싱에 의해 식별됩니다.
Abstract
Prototrophic 박테리아는 탄소 및 에너지 원으로 사용되는 배지 글루코오스 (M-9 배지)로 보충 M-9 최소 염에 성장. 영양 요구는 transposome를 이용하여 생성 될 수있다. 이 프로토콜에 사용되는 상용, 테네시 (5) 유도 된 transposome은 트랜스 결합 부위의 역할을 R6K γ 복제 기원, 카나마이신 저항과 두 개의 모자이크 순서 종료하는 유전자를 포함하는 DNA의 선형 세그먼트로 구성되어 있습니다. DNA / 트랜스 단백질 복합체로서 제공 transposome는, prototrophic 균주, 엔테로 SP는 일렉트로로 도입된다. YSU, 그리고 무작위로이 숙주의 게놈에 자신을 통합합니다. 형질 전환 체는 카나마이신 (LB 칸)을 함유하는 한천 플레이트 루리아 – 베르 타니에 도금 복제본 카나마이신 (M-9 칸)을 함유하는 M-9 배지 아가 플레이트 상이다. M-9 칸 접시에 LB-관 판에 성장하지만 형질 전환 영양 요구로 간주됩니다. 정제 게놈영양 요구로부터 DNA는 부분적으로 소화 PIR + 대장균 (E. 콜라이) 균주에 결찰 및 변환된다. R6Kγ 복제 원점은 플라스미드 PIR + E.에 복제 할 수 있습니다 콜라이 균주 및 카나마이신 저항 마커 플라스미드의 선택을 허용한다. 각 형질 전환 중단 된 염색체 영역에 의해 측면에 트랜스포존을 포함하는 새로운 플라스미드를 보유하고있다. 생거 시퀀싱 및 기본 지역 맞춤 검색 도구 (BLAST)는 중단 된 유전자의 추정 정체성을 제안한다. 이 transposome 돌연변이 유발 전략을 사용하는 세 가지 이점이있다. 첫째, 호스트에 의한 트랜스 유전자의 발현에 의존하지 않는다. 둘째, transposome는 전기에 의하여보다는 접합 또는 형질 도입에 의하여 대상 호스트에 도입하고, 따라서보다 효율적이다. 셋째, R6Kγ 복제 원점 쉽게 돌연변이 g을 식별 할 수있게부분적으로 재조합 플라스미드에 복구 에너지. 이 기술은 엔테로 박터 (SP)의 다른 특성에 관여하는 유전자를 조사하기 위하여 사용될 수있다. YSU 또는 균주의 넓은 다양한.
Introduction
Prototrophic 박테리아 생합성 1, 아미노산, 핵산, 비타민 등의 전구체를 생성하도록 중앙 탄소 대사 경로를 통해 글루코즈 변환 매체 글루코스 (M-9 매체)를 포함하는 M-9 최소 염 성장. M-9 매체는 탄소 및 에너지 원으로서 황 공급원 및 글루코스 버퍼 및 인 소스, 황산 마그네슘 등의 질소원, 나트륨 및 인산 칼륨 등의 암모늄 클로라이드를 포함한다. 루리아 – 베르 타니 (LB) 배지 트립에서 효모 추출물 비타민과 성장 인자의 아미노산이 풍부하다. 그것은 M-9 매체 상 성장에 필요한 아미노산, 비타민 및 다른 성장 인자를 합성 할 수없는 영양 요구의 성장을 지원한다. 영양 요구는 M-9 매체에 LB 배지에서 성장할 수 있지만 반면 따라서 prototrophs는 LB 및 M-9 배지에서 성장할 것이다. 영양 요 구성 돌연변이 표현형을 야기하는 유전자를 박테리아 prototrophic 인구에 돌연변이를 도입하고 식별함으로써, 포는균주의 대사의 더 나은 이해를 얻을 ssible.
트랜스포존 돌연변이는 M-9 배지에서 포도당에서의 성장에 필요한 유전자의 대부분을 식별하는데 사용될 수있다. 트랜스포존는 숙주 게놈 2에 무작위로 자신을 삽입합니다. M-9 배지 아가 플레이트 상에 LB 아가 플레이트 및 이들을 도금 복제본 트랜스포존 형질을 스폿 팅함으로써, 영양 요구 스크리닝 할 수있다. 중단 된 유전자는 유전자 구조를 통해 확인된다. 본 연구는 시판 테네시 5 트랜스 단백질과 혼합 선형 트랜스포존 DNA 세그먼트의 용액으로서 제공되는 transposome – 유래를 이용한다. DNA 세그먼트는 트랜스 유전자가 부족하지만 카나마이신 저항성 유전자, R6K γ 복제 원점과 세그먼트 3,4의 각 끝 부분에 결합 트랜스에 대한 DNA 서열 두 개의 모자이크 모티브가 포함되어 있습니다. 트랜스 단백질은 DNA 단독 DNA 세그먼트에 직접 첨가되어 있기 때문에트랜스포존으로 정의되고, DNA / 트랜스 단백질 복합체 transposome로서 정의된다. transposome은 카나마이신 민감한 호스트 (그림 1A)에 전기 (5)에 의해 변환된다. 카나마이신 (LB 칸)을 함유하는 LB 아가 플레이트상에서 성장 콜로니를 카나마이신 (M-9 칸) 영양 요구 아르 함유 M-9 배지 아가 플레이트상에서 성장되지 트랜스포존 삽입 (도 1B), 및 복제 도금 형질 (Figire있을 1C). 돌연변이로부터 게놈 DNA 정제 부분적 4베이스 절삭 제한 엔도 뉴 클레아 제, BFU CI (도 1D)로 분해된다. DNA 라이 게이션은 그 PIR 유전자 (도 1E)를 포함 대장균 (E. 콜라이)의 균주에 형질 전환된다. 이 유전자는 새로운 플라스미드 트랜스포존을 포함하고 E.에서 복제 호스트 염색체 영역을 측면에서는 수 있습니다 대장균 6. 카나마이신 내성 유전자와 같은 역할새로운 플라스미드에 대한 electable 마커. 마지막으로, 중단 유전자의 신원을 결정하는 데 사용되는 트랜스포존 얻어진 시퀀스의 기본 로컬 검색 정렬 도구 (BLAST) 분석 7,8의 각 단부에 상보적인 프라이머를 이용하여 시퀀싱.
이 transposome 돌연변이 유발 전략은 세 가지 장점 (3)를 제공한다. 트랜스 단백질 트랜스포존에 직접 결합되기 때문에 먼저, 삽입 호스트 내의 트랜스 유전자의 발현에 의존하지 않는다. 트랜스포존은 숙주 게놈 내로 그 자체를 포함하면 트랜스는 트랜스포존의 추가적인 이동을 방지 저하된다. 호스트가 내인성 테네시 5 transpositional 요소를 소유하는 경우에는, 추가 이동이 방지 될 수 없다. 둘째로, 전기 천공에 의해 도입 transposome은 가능한 호스트 다양한 그것을 사용한다. 또한 접합하여 또는 VI를하여 트랜스포존을 도입 할 필요성을 제거RAL 감염. 두 프로세스는 호스트 감수성을 필요로한다. 셋째, 카나마이신 내성 유전자 및 transposome에서 γ R6K 복제 기원의 포함은 쉽게 중단 유전자를 식별 할 수있다. 트랜스포존 중단 영역 저장 및 유전자 식별을위한 역 폴리머 라제 연쇄 반응 (PCR) 기술을 사용할 필요가 없어, 플라스미드로 서열화 될 수있다.
이 비디오에 제시된 프로토콜은 엔테로 박터 SP의 트랜스포존 돌연변이 유발을위한 각 단계를 설명합니다. YSU 9는 중단 추정되는 유전자의 식별에 박테리아 세포에 도입에서 transposome를 사용하여. 이전에 출판 프로토콜 3,4,10 이외에 영양 요구에 대해 스크리닝 복제본 도금을 사용하는 상세한 방법이 제시된다. 이 돌연변이 유발 기술은 식별자에 대한 박테리아의 다른 유형에서, 그러한 항생제 저항과 금속과 같은 다른 표현형을 조사하기 위해 사용될 수있다또는 유전학 또는 미생물 생리학 코스의 실험실 구성 요소를 가르치는 합성 생물학 연구에서 정의 된 배양 조건에서 성장에 필요한 유전자의 최소한의 수를 ifying.
Protocol
Representative Results
Discussion
transposome을 사용하여 트랜스포존 돌연변이 유발 엔테로 SP의 영양 요구를 생성하기위한 효과적인 도구이다. YSU과 그람 음성의 다른 유형과 그람 양성 세균 3,4. 프로세스는 일렉트로 의해 숙주에 테네시 5 유래 transposome 도입함으로써 개시 하였다. 인서트 콜로니를 확인하기 위하여, 변형되지 않은 대상 균주는 트랜스포존에 의해지지 저항 마커 선택하기 위해 카나마이신에 민…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 2010-2014 봄 학기 동안 내 트랜스포존 돌연변이 유발 아이디어를 테스트 내 미생물 생리학 대학원생의 학부 독립적 인 연구의 모든 학생 모두에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 영스 타운 주립 대학의 생물학의 부에 의해 투자되었다.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit | Epicentre (Illumina) | TSM08KR | |
| EC100D pir+ Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | ECP09500 | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number |
| EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | EC6P095H | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number |
| 5X M-9 Salts | Thermo Fisher | DF048517 | |
| Lennox LB Broth | Thermo Fisher | BP1427-2 | |
| Agar | Amresco, Inc. | J637-1KG | Solid media contained 1.6% (w/v) agar |
| Kanamycin Sulfate | Amresco, Inc. | 0408-25G | When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate |
| D-Glucose Monohydrate | Amresco, Inc. | 0643-1KG | |
| Yeast Extract | Amresco, Inc. | J850-500G | |
| Tryptone | Amresco, Inc. | J859-500G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | |
| NaCl | Amresco, Inc. | X190-1KG | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO2 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium | 0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose | ||
| BfuC I | NEB | R0636S | Partial digestion of genomic DNA |
| Xho I | NEB | R0146S | Plasmid digestion |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Nuclease Free Water | Amresco, Inc. | E476-1L | For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions |
| GenomeLab DTCS – Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | DNA sequencing |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120A | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1460 | Plasmid purification |
| Replica Plating Block | Thermo Fisher | 09-718-1 | |
| Velveteen Squares | Thermo Fisher | 09-718-2 | Replica plating |
| PetriStickers | Diversified Biotech | PSTK-1100 | Grid for replica plating |
| Petri Dishes | Thermo Fisher | FB0875712 | |
| Gene Pulser II | BioRad | Electroporation | |
| Electroporation Cuvettes – 2 mm | BioExpress | E-5010-2 | |
| CentriVap DNA Vacuum Concentrator | Labconco | 7970010 | Drying DNA |
| CEQ 2000XL DNA Analysis System | Beckman Coulter | DNA sequencing | |
| Vector NTI Advance 11.5.0 | Life Technologies | 12605099 | DNA sequence analysis |
Riferimenti
- Kim, B. H., Gadd, G. M. . Bacterial physiology and metabolism. , (2008).
- Hayes, F. Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics. Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).
- Hoffman, L. M. Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes. Methods in molecular biology. 765, 55-70 (2011).
- Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes. Nature biotechnology. 18 (1), 97-100 (2000).
- Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
- Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6Kγ origin plasmids at different copy numbers. Gene. 138 (1-2), 1-7 (1994).
- Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Schäffer, A. a Database indexing for production MegaBLAST searches. Bioinformatics. 24 (16), 1757-1764 (2008).
- Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7 (1-2), 203-214 (2000).
- Holmes, A., Vinayak, A., et al. Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02. Current microbiology. 59 (5), 526-531 (2009).
- Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes. Genetica. 108 (1), 19-24 (2000).
- Ausubel, F., Brent, R., et al. . Short Protocols in Molecular Biology. , (1997).
- Miller, J. H. . A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, (1992).
- Gibson, M. I., Gibson, F. Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid. The Biochemical journal. 90 (2), 248-256 (1964).
- Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), (2003).
- Reznikoff, W., Winterberg, K. Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes. Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).
- Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. Random genome deletion methods applicable to prokaryotes. Applied Microbiology and Biotechnology. 79 (4), 519-526 (2008).
- Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J. Knowledge-making distinctions in synthetic biology. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 30 (1), 57-65 (2008).
- Zheng, Y. -. N., Li, L. -. Z., et al. Problems with the microbial production of butanol. Journal of industrial microbiolog., & biotechnology. 36 (9), 1127-1138 (2009).
