Generación de<em> Enterobacter</em> Sp. YSU auxótrofos Usando transposón mutagénesis
Summary
Enterobacter sp. YSU crece en glucosa medio mínimo de sales. Auxótrofos se generan mediante la transformación con un transposome que se inserta aleatoriamente en el genoma huésped. Los mutantes se encuentran por réplica en placas de medio complejo a medio mínimo. Genes interrumpidos se identifican por el rescate y la secuenciación de genes.
Abstract
Prototrophic bacterias crecen en M-9 mínimo de sales suplementado con glucosa (M-9) medio, que se utiliza como fuente de carbono y energía. Auxótrofos se pueden generar utilizando un transposome. El comercialmente disponible, Tn 5 transposome -derivado utilizado en este protocolo consiste en un segmento lineal de ADN que contiene un origen de replicación R6K γ, un gen para resistencia a la kanamicina y dos secuencias de mosaico extremos, que sirven como sitios de unión de transposasa. El transposome, siempre como un complejo de proteínas de ADN / transposasa, se introdujo por electroporación en la cepa prototrófica, Enterobacter sp. YSU, e incorpora al azar en el genoma de este host. Los transformantes son réplica en placas sobre agar Luria-Bertani placas que contenían kanamicina, (LB-kan) y en placas de agar M-9 medio que contiene kanamicina (M-9-kan). Los transformantes que crecen en placas de LB-kan pero no en placas M-9-kan se considera que son auxótrofos. Genómico purificadoADN de un auxótrofo se digiere parcialmente, se ligó y se transformó en un pir + Escherichia coli (E. coli) cepa. El origen de replicación R6Kγ permite que el plásmido se replica en pir + E. cepas de E. coli, y el marcador de resistencia a kanamicina permite la selección del plásmido. Cada transformante posee un nuevo plásmido que contiene el transposón flanqueado por la región cromosómica interrumpido. Secuenciación de Sanger y la Local Alignment Search Tool Básica (BLAST) sugieren una identidad supuesta del gen interrumpido. Hay tres ventajas de utilizar esta estrategia de mutagénesis transposome. En primer lugar, no se basa en la expresión de un gen de transposasa por el anfitrión. En segundo lugar, la transposome se introduce en el host de destino mediante electroporación, en vez de por conjugación o por transducción y por lo tanto es más eficiente. En tercer lugar, el origen de replicación R6Kγ hace que sea fácil de identificar la mutación geno que se recupera parcialmente en un plásmido recombinante. Esta técnica se puede utilizar para investigar los genes implicados en otras características de Enterobacter sp. YSU o de una variedad más amplia de cepas bacterianas.
Introduction
Prototrophic bacterias crecen en M-9 que contenían medio mínimo de sales glucosa (M-9) medio, la conversión de glucosa a través de vías centrales del metabolismo de carbono para generar precursores, tales como aminoácidos, ácidos nucleicos y vitaminas, para la biosíntesis de 1. M-9 medio contiene cloruro de amonio como fuente de nitrógeno, sodio y fosfato de potasio como un tampón y fuente de fósforo, sulfato de magnesio como una fuente de azufre y glucosa como fuente de carbono y energía. Luria-Bertani (LB) medio es rico en aminoácidos de triptona y en vitaminas y factores de crecimiento a partir de extracto de levadura. Es compatible con el crecimiento de los auxótrofos que no pueden sintetizar aminoácidos, vitaminas y otros factores de crecimiento necesarios para el crecimiento en medio M-9. Por lo tanto, prototrofos crecerán en LB y medio M-9, mientras que auxótrofos crecerán en medio LB, pero no en medio M-9. Mediante la introducción de mutaciones en una población prototrophic de bacterias y la identificación de genes mutados que causan fenotipos auxotróficas, es possible para obtener una mejor comprensión del metabolismo en una cepa bacteriana.
Mutagénesis de transposón puede ser usado para identificar muchos de los genes necesarios para el crecimiento en glucosa en medio M-9. Los transposones se insertan aleatoriamente en el genoma huésped 2. Mediante la identificación de transformantes transposón en placas de agar LB y réplica en placas sobre placas de ellos M-9 de agar de medio, es posible para la detección de auxótrofos. Genes interrumpidos se identifican a través de rescate de genes. Este estudio utiliza un comercialmente disponible Tn 5 -derivado transposome que se suministra como una solución de un segmento de ADN transposón lineal mixto con la proteína transposasa. El segmento de ADN carece de un gen de la transposasa, pero contiene un gen de resistencia a la kanamicina, un origen de replicación γ R6K y dos motivos de mosaico que son secuencias de ADN para la transposasa de unión en cada extremo del segmento de 3,4. Dado que la proteína transposasa se añade directamente al ADN, el segmento de ADN solose define como el transposón, y el complejo de proteínas de ADN / transposasa se define como la transposome. El transposome se transformó por electroporación en un 5 kanamicina sensibles host (Figura 1A). Las colonias que crecen en placas de agar LB que contenían kanamicina (LB-kan) tienen inserciones de transposones (Figura 1B), y réplicas de chapado en transformantes que no crecen en M-9 placas de medio de agar que contiene kanamicina (M-9-kan) son auxótrofos (Figire 1C). El ADN genómico de un mutante es purificado y parcialmente digerido con la endonucleasa de restricción de corte 4-base, BFU CI (Figura 1D). El ADN ligado se transformó en una cepa de Escherichia coli (E. coli) que contiene el gen pir (Figura 1E). Este gen permite que el nuevo plásmido que contiene el transposón y región flanqueante cromosómico del huésped para replicarse en E. coli 6. El gen de resistencia a kanamicina sirve como comomarcador elegible para el nuevo plásmido. Por último, la secuenciación usando cebadores complementarios a cada extremo del transposón y Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8 análisis de la secuencia resultante se usan para determinar la identidad de los genes interrumpidos.
Esta estrategia de mutagénesis transposome ofrece tres ventajas 3. En primer lugar, ya que la proteína transposasa se une directamente a la transposón, la inserción no depende de la expresión del gen transposasa dentro del huésped. Una vez que el transposón se incorpora en el genoma huésped, la transposasa se degrada, impidiendo el movimiento adicional del transposón. Sin embargo, el movimiento adicional que no se puede evitar si el host posee un 5 Tn elemento transposicional endógeno. En segundo lugar, la introducción de la transposome por electroporación hace que sea posible su uso en una amplia variedad de huéspedes. También elimina la necesidad de introducir el transposón por conjugación bacteriana o por viinfección ral. Ambos procesos requieren la susceptibilidad del huésped. En tercer lugar, la inclusión del gen de resistencia a kanamicina y el origen de replicación R6K γ en el transposome hace que sea más fácil identificar el gen interrumpido. Regiones de tipo transposón interrumpida se pueden almacenar y se secuenciaron como plásmidos, lo que elimina la necesidad de utilizar la reacción en cadena inversa de la polimerasa (PCR) para la identificación de genes.
El protocolo presentado en este video se describe cada paso por transposón mutagénesis de Enterobacter sp. YSU 9 usando un transposome de su introducción en las células bacterianas a la identificación del gen putativo se interrumpió. Además de los protocolos publicados previamente 3,4,10, se presentan métodos detallados para el uso de réplica en placa para detectar auxotrofos. Esta técnica de mutagénesis puede utilizarse para la investigación de otros fenotipos, tales como antibióticos y resistencias de metal, en diferentes tipos de bacterias, por identifying el número mínimo de genes necesarios para el crecimiento en condiciones de cultivo definidos en los estudios de biología sintética, o para la enseñanza de un componente de laboratorio de una genética o curso de fisiología microbiana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Transposón mutagénesis usando un transposome es una herramienta eficiente para generar auxotrofos en Enterobacter sp. YSU y otros tipos de bacterias Gram negativas y Gram positivas 3,4. El proceso se inició mediante la introducción del Tn 5 transposome -derivado en el huésped por electroporación. Para identificar colonias con insertos, la cepa no transformada objetivo tenía que ser sensibles a la kanamicina para seleccionar para el marcador de resistencia llevado por el transposón. A…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El autor desea agradecer a todos mis estudiantes de pregrado de Investigación Independiente y todos mis estudiantes de posgrado Fisiología Microbiana que probaron mis ideas de mutagénesis de transposón durante los semestres de primavera 2010-2014. Este trabajo fue financiado por el Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad Estatal de Youngstown.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit | Epicentre (Illumina) | TSM08KR | |
| EC100D pir+ Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | ECP09500 | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number |
| EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | EC6P095H | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number |
| 5X M-9 Salts | Thermo Fisher | DF048517 | |
| Lennox LB Broth | Thermo Fisher | BP1427-2 | |
| Agar | Amresco, Inc. | J637-1KG | Solid media contained 1.6% (w/v) agar |
| Kanamycin Sulfate | Amresco, Inc. | 0408-25G | When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate |
| D-Glucose Monohydrate | Amresco, Inc. | 0643-1KG | |
| Yeast Extract | Amresco, Inc. | J850-500G | |
| Tryptone | Amresco, Inc. | J859-500G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | |
| NaCl | Amresco, Inc. | X190-1KG | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO2 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium | 0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose | ||
| BfuC I | NEB | R0636S | Partial digestion of genomic DNA |
| Xho I | NEB | R0146S | Plasmid digestion |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Nuclease Free Water | Amresco, Inc. | E476-1L | For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions |
| GenomeLab DTCS – Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | DNA sequencing |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120A | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1460 | Plasmid purification |
| Replica Plating Block | Thermo Fisher | 09-718-1 | |
| Velveteen Squares | Thermo Fisher | 09-718-2 | Replica plating |
| PetriStickers | Diversified Biotech | PSTK-1100 | Grid for replica plating |
| Petri Dishes | Thermo Fisher | FB0875712 | |
| Gene Pulser II | BioRad | Electroporation | |
| Electroporation Cuvettes – 2 mm | BioExpress | E-5010-2 | |
| CentriVap DNA Vacuum Concentrator | Labconco | 7970010 | Drying DNA |
| CEQ 2000XL DNA Analysis System | Beckman Coulter | DNA sequencing | |
| Vector NTI Advance 11.5.0 | Life Technologies | 12605099 | DNA sequence analysis |
Riferimenti
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