Generatie<em> Enterobacter</em> Sp. YSU auxotrofen behulp Transposon Mutagenesis
Summary
Enterobacter sp. YSU groeit in glucose minimale zouten medium. Auxotrofen worden gegenereerd door transformatie met een transposome die willekeurig plaatst zichzelf in het gastheergenoom. Mutanten worden gevonden door replica plating van complexe medium tot minimaal medium. Onderbroken genen worden geïdentificeerd door gen-rescue en sequencing.
Abstract
Prototrofe bacteriën groeien op M-9 minimale zouten medium aangevuld met glucose (M-9 medium), welke wordt gebruikt als een koolstof- en energiebron. Auxotrofen kan worden gegenereerd met behulp van een transposome. De commercieel verkrijgbare, Tn 5 -afgeleide transposome gebruikt in dit protocol bestaat uit een lineair segment van DNA dat een R6K γ replicatieoorsprong, een gen voor kanamycine resistentie en twee mozaïek sequentie eindigt, die als transposase bindingsplaatsen. De transposome, verschaft als een DNA / transposase eiwit complex wordt geïntroduceerd door elektroporatie in de stam prototroof, Enterobacter sp. YSU, en integreert zich willekeurig in het genoom van deze host. Transformanten zijn replica uitgeplaat op Luria-Bertani agar platen die kanamycine, (LB-kan) en op M-9 medium agarplaten die kanamycine (M-9-kan). De transformanten die groeien op LB-kan borden maar niet op M-9-kan kentekenplaten geacht auxotrofen zijn. Gezuiverd genomischeDNA van een auxotroph wordt gedeeltelijk verteerd, geligeerd en getransformeerd in een PIR + Escherichia coli (E. coli) stam. De R6Kγ replicatieoorsprong kan het plasmide te repliceren in pir + E. coli-stammen, en de kanamycineresistentie marker zorgt voor plasmide selectie. Elke transformant bezit een nieuw plasmide dat het transposon geflankeerd door de onderbroken chromosomale regio. Sanger sequencing en de Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) suggereren een vermeende identiteit van de onderbroken gen. Er zijn drie voordelen om met deze transposome mutagenese strategie. Ten eerste is het niet vertrouwen op de expressie van een transposase gen van de gastheer. Ten tweede wordt de transposome in het doel gastheer geïntroduceerd door elektroporatie, niet door conjugatie of transductie en daarom efficiënter. Ten derde, de R6Kγ replicatieoorsprong maakt het gemakkelijk om de gemuteerde g identificerenene die gedeeltelijk wordt teruggewonnen in een recombinant plasmide. Deze techniek kan worden gebruikt om de genen in andere kenmerken van Enterobacter sp. YSU of meer verschillende bacteriestammen.
Introduction
Prototrofe bacteriën groeien op M-9 minimale zouten medium glucose (M-9 medium) bevattende glucose omzetten door de centrale koolstof metabolisme routes voorlopers, zoals aminozuren, nucleïnezuren en vitaminen genereren voor biosynthese 1. M-9 medium bevat ammoniumchloride als een stikstofbron, natrium en kalium fosfaat als buffer en fosforbron, magnesium sulfaat als zwavelbron en glucose als koolstof- en energiebron. Luria-Bertani (LB) medium rijk aan aminozuren van trypton en vitaminen en groeifactoren uit gistextract. Het ondersteunt de groei van auxotrofen die aminozuren, vitaminen en andere groeifactoren vereist voor groei op M-9 medium niet kan synthetiseren. Zo zal prototrofen groeien in LB en M-9 medium, terwijl auxotrofen groeien in LB-medium, maar niet in M-9 medium. Door het introduceren van mutaties in een prototrofe bacteriepopulatie en identificatie gemuteerde genen die auxotrofe fenotypes veroorzaken, is het possible een beter begrip van het metabolisme in een bacteriële stam te verkrijgen.
Transposon mutagenese kan worden gebruikt om veel van de genen die nodig zijn voor groei op glucose in M-9 medium identificeren. Transposons voegen zich willekeurig in het gastheergenoom 2. Door het spotten transposon transformanten op LB-agarplaten en replica uitplaten ze op M-9 medium agarplaten, kan men screenen voor auxotrofen. Onderbroken genen worden geïdentificeerd door middel van genetische rescue. Deze studie maakt gebruik van een in de handel verkrijgbaar Tn 5 -afgeleide transposome die wordt geleverd als een oplossing van een lineair transposon DNA-segment gemengd met transposase eiwit. Het DNA-segment mist een transposase-gen, maar bevat een gen voor kanamycine resistentie, een R6K γ replicatieoorsprong en twee mozaïekmotief die DNA sequenties voor transposase binden aan elk uiteinde van het segment 3,4 zijn. Aangezien het transposase eiwit direct toegevoegd aan het DNA, de DNA-segment alleenwordt gedefinieerd als het transposon en de DNA / transposase eiwit complex wordt gedefinieerd als de transposome. De transposome wordt getransformeerd door elektroporatie 5 in een kanamycine gevoelige gastheer (Figuur 1A). Kolonies die groeien op LB-agarplaten die kanamycine (LB-kan) hebben transposon inserts (Figuur 1B), en replica uitgeplaat transformanten die niet groeien op M-9 medium agarplaten die kanamycine (M-9-kan) zijn auxotrofen (Figire 1C). Genomisch DNA van een mutant is gezuiverd en gedeeltelijk gedigereerd met 4-base knippende restrictie endonuclease, BFU CI (figuur 1D). Het geligeerde DNA wordt getransformeerd in een stam van Escherichia coli (E. coli) die het pir gen (figuur 1E) bevat. Dit gen maakt de nieuwe plasmide dat het transposon en flankerende chromosomale regio repliceren in E. coli 6. De kanamycine resistentiegen fungeert alsverkiesbare marker voor de nieuwe plasmide. Tenslotte sequentiebepaling met primers complementair aan elk uiteinde van de transposon en Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8 analyse van de resulterende sequentie worden gebruikt om de identiteit van de onderbroken genen bepalen.
Dit transposome mutagenesestrategie biedt drie voordelen 3. Ten eerste, omdat het transposase eiwit direct gebonden aan het transposon insertie niet afhangt van de expressie van het transposase-gen in de gastheer. Zodra het transposon omvat zelf in het gastheergenoom, wordt de transposase afgebroken, waardoor extra beweging van het transposon. Echter, kan extra beweging niet worden voorkomen als de gastheer bezit een endogene Tn 5 transpositional element. Tweede, invoering van de transposome door elektroporatie maakt het mogelijk om het te gebruiken in een grote verscheidenheid van gastheren. Het elimineert tevens de noodzaak om de transposon voeren door bacteriële conjugatie of viral infectie. Beide processen vereisen waardplantgevoeligheid. Ten derde, opname van de kanamycine resistentie gen en de R6K γ replicatieoorsprong in de transposome vergemakkelijkt de onderbroken gen te identificeren. Transposon-onderbroken gebieden worden bewaard en de sequentie plasmiden, waardoor de noodzaak om de inverse polymerase chain reaction (PCR) techniek voor gen-identificatie.
De in deze video protocol beschrijft elke stap transposon mutagenese van Enterobacter sp. YSU 9 met een transposome van het inbrengen ervan in de bacteriecellen op het identificeren van de vermoedelijke gen dat onderbroken. Naast de eerder gepubliceerde protocollen 3,4,10 zijn nauwkeurige werkwijzen voor het gebruik replica plating te screenen voor auxotrofen gepresenteerd. Deze mutagenese techniek kan worden gebruikt voor het onderzoeken fenotypes, zoals antibiotica en metaal weerstanden, verschillende soorten bacteriën, identcerende het minimale aantal genen die nodig zijn voor de groei onder gedefinieerde kweekomstandigheden in de synthetische biologie studies, of voor het onderwijzen van een laboratorium onderdeel van een genetica of microbiële fysiologie cursus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Transposon mutagenese met behulp van een transposome is een efficiënte tool voor het genereren auxotrofen in Enterobacter sp. YSU en andere vormen van Gram-negatieve en Gram-positieve bacteriën 3,4. Het proces werd geïnitieerd door de invoering van de Tn 5-afgeleide transposome in de gastheer door middel van elektroporatie. Om kolonies te identificeren met inserts, de ongetransformeerde stam doel moest gevoelig voor kanamycine voor het selecteren van de resistentiemerker de transposon uit…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteur wil graag al mijn undergraduate Independent Research Studenten en al mijn Microbiële Fysiologie afgestudeerde studenten die mijn transposon mutagenese ideeën tijdens de 2010-2014 lentesemesters getest bedanken. Dit werk werd gefinancierd door de Afdeling Biologische Wetenschappen aan Youngstown State University.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit | Epicentre (Illumina) | TSM08KR | |
| EC100D pir+ Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | ECP09500 | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number |
| EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | EC6P095H | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number |
| 5X M-9 Salts | Thermo Fisher | DF048517 | |
| Lennox LB Broth | Thermo Fisher | BP1427-2 | |
| Agar | Amresco, Inc. | J637-1KG | Solid media contained 1.6% (w/v) agar |
| Kanamycin Sulfate | Amresco, Inc. | 0408-25G | When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate |
| D-Glucose Monohydrate | Amresco, Inc. | 0643-1KG | |
| Yeast Extract | Amresco, Inc. | J850-500G | |
| Tryptone | Amresco, Inc. | J859-500G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | |
| NaCl | Amresco, Inc. | X190-1KG | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO2 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium | 0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose | ||
| BfuC I | NEB | R0636S | Partial digestion of genomic DNA |
| Xho I | NEB | R0146S | Plasmid digestion |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Nuclease Free Water | Amresco, Inc. | E476-1L | For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions |
| GenomeLab DTCS – Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | DNA sequencing |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120A | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1460 | Plasmid purification |
| Replica Plating Block | Thermo Fisher | 09-718-1 | |
| Velveteen Squares | Thermo Fisher | 09-718-2 | Replica plating |
| PetriStickers | Diversified Biotech | PSTK-1100 | Grid for replica plating |
| Petri Dishes | Thermo Fisher | FB0875712 | |
| Gene Pulser II | BioRad | Electroporation | |
| Electroporation Cuvettes – 2 mm | BioExpress | E-5010-2 | |
| CentriVap DNA Vacuum Concentrator | Labconco | 7970010 | Drying DNA |
| CEQ 2000XL DNA Analysis System | Beckman Coulter | DNA sequencing | |
| Vector NTI Advance 11.5.0 | Life Technologies | 12605099 | DNA sequence analysis |
Riferimenti
- Kim, B. H., Gadd, G. M. . Bacterial physiology and metabolism. , (2008).
- Hayes, F. Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics. Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).
- Hoffman, L. M. Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes. Methods in molecular biology. 765, 55-70 (2011).
- Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes. Nature biotechnology. 18 (1), 97-100 (2000).
- Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
- Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6Kγ origin plasmids at different copy numbers. Gene. 138 (1-2), 1-7 (1994).
- Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Schäffer, A. a Database indexing for production MegaBLAST searches. Bioinformatics. 24 (16), 1757-1764 (2008).
- Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7 (1-2), 203-214 (2000).
- Holmes, A., Vinayak, A., et al. Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02. Current microbiology. 59 (5), 526-531 (2009).
- Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes. Genetica. 108 (1), 19-24 (2000).
- Ausubel, F., Brent, R., et al. . Short Protocols in Molecular Biology. , (1997).
- Miller, J. H. . A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, (1992).
- Gibson, M. I., Gibson, F. Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid. The Biochemical journal. 90 (2), 248-256 (1964).
- Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), (2003).
- Reznikoff, W., Winterberg, K. Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes. Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).
- Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. Random genome deletion methods applicable to prokaryotes. Applied Microbiology and Biotechnology. 79 (4), 519-526 (2008).
- Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J. Knowledge-making distinctions in synthetic biology. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 30 (1), 57-65 (2008).
- Zheng, Y. -. N., Li, L. -. Z., et al. Problems with the microbial production of butanol. Journal of industrial microbiolog., & biotechnology. 36 (9), 1127-1138 (2009).
