测量时空的Ca^{2 +}在拟南芥信号

Summary

^的 Ca ^{2 +}信号调控植物中不同的生物过程。在这里，我们提出的方法用于监测非生物胁迫诱导的时空钙在拟南芥的细胞，并使用基因编码的^钙指标水母发光蛋白或Case12组织^{2 +}信号。

Abstract

发展与环境线索诱发^的 Ca ^{2 +}的波动在植物细胞中。刺激特定的空间-时间^的 Ca ^{2 +}的图案是由发起^的 Ca ^{2 +}信号传导级联的细胞^的 Ca ^{2 +}结合蛋白的检测。但是，我们仍然知之甚少如何刺激产生特定的^钙信号。 à ^钙离子信号的特殊性可能是由于^钙离子通道和/或转运活动的复杂调控响应给定的刺激。识别这些细胞成分和理解它们的功能，关键的是要使用的系统，允许^的 Ca ^{2 +}信号的灵敏和鲁棒记录同时在组织和细胞水平。基因编码的定位到不同的细胞^钙指标都规定了细胞^钙信号活细胞共聚焦成像的平台。在这里，我们描述的指令S为使用两^钙离子检测系统：基于水母发光蛋白FAS（薄膜粘合苗）发光^钙成像和case12基于活细胞共聚焦荧光^钙离子成像。使用FAS系统发光成像提供了一种简单，可靠和灵敏的检测的空间和时间^的 Ca ^{2 +}信号，在组织水平的，同时采用Case12活细胞的共聚焦成像提供同时检测胞质和核^的 Ca ^{2 +}信号中的较高的分辨率。

Introduction

植物细胞响应该坐标细胞动作经由信令环境。早期的细胞在应对环境刺激信号事件是一个短暂的^钙增加。的图案，或一过性升高签名中游离^的 Ca ^{2 +}浓度的特征在于，其振幅，频率和持续时间。不同的时空^钙签名规范不同的细胞活动^1。特定刺激，如热，冷，盐，干旱，光，或植物激素，可以微调膜本地化^的 Ca ^{2 +}通道和/或转运的时空活性，导致具体^的 Ca ^{2 +}的签名。虽然^钙离子转运都得到很好的特点，鲜为人知的是， ^钙离子通道在植物¹分子的身份和功能。对于突变体遗传筛选具有改变^的 Ca ^{2 +}响应强调刺激可能是一种有效APPRoach用于识别构成^的 Ca ^{2 +}的签名的组件。最近基于几个水母发光蛋白^的 Ca ^{2 +}检测系统已被开发，以促进遗传筛选的^钙响应于病原体攻击和非生物胁迫^2-4信令组件。

水母发光蛋白最早是用于检测钙在植物体内^离子信号在90年代初^5。从那时起，水母发光蛋白已经被定位到不同的细胞区室，如细 ​​胞质^5，核^6，叶绿体^7，液泡膜^8，线粒体⁹和基质^10，以及不同的细胞类型中的根来监视特定的Ca ²细胞⁺信号^11。基于水母发光蛋白^钙离子的测量揭示细胞应力刺激人口的空间和时间^的 Ca ^{2 +}的响应。然而，在大多数情况下，单个细胞的^钙离子的反应是unsynchroni捷思在响应组织^4。因此，水母发光蛋白^的 Ca ^{2 +}的记录不一定报告在个体细胞中的^钙信号。近年来，基因编码荧光蛋白（FP）为基础^的 Ca ^{2 +}的指标，如黄色卡默莱昂^（YCS）12和CASEs12 ¹³已被用于研究^的 Ca ^{2 +}具有高亚细胞分辨率的信号。 YCS是荧光共振能量转移（FRET）为基础^的 Ca ^{2 +}的指标，含有CFP和YFP的变体由钙挂钩^{2 +}结合蛋白钙调蛋白和钙调蛋白结合肽M13。钙调蛋白发生构象变化，因为它结合^的 Ca ^{2 +，}由此带来的CFP和YFP更加靠近，从而增加了能量转移（FRET增强）。随着时间的荧光共振能量转移的水平，大约为YFP对CFP信号强度的比值计算，反映了细胞内^钙离子动态。几个YC版本已被用于在植物中。 YC3.6为吨argeted到细胞质^14,15，核^16，线粒体^17，和质膜^18，和YC4.6和D4ER被定位到ER ^15,19，和D3cpv被靶向过氧化物酶体^20。转基因植物表达YCS允许不同类型的细胞不同的细胞内^钙离子动态的活细胞成像。例（大概钙 lcium 本身 nsor）是单圆置换荧光蛋白（cpFPs）窝藏钙调蛋白和钙调蛋白结合肽M13。结合后^的 Ca ^{2 +，}情况发生构象变化，从而导致增加的荧光强度。该案例的荧光响应和Ca ^{2 +}浓度之间的相关性使得细胞内^钙离子动力学来进行定量测定。在^钙 -饱和脂肪形式Case12变种12倍的增加荧光。N。 benthiminana植物瞬时EXPRessing Case12或拟南芥稳定表达病例12为材料，研究^钙信号在国防和非生物胁迫^4,21。异步时空^钙离子振荡，细胞应对病原体的攻击，或脱水的压力已经显露了Case12基于^钙离子成像。

在这里，我们提出的组织-和刺激基于水母发光蛋白发光成像特定的CA在拟南芥幼苗^离子动力，并为细胞内的共焦成像与核钙的详细说明，在拟南芥根细胞^离子的动态表达的FAS案例12发光成像可适于分析在完整植物或此处未描述的组织应力诱导^的 Ca ^{2 +}的动态，或筛选诱变的拟南芥属植物种群，对具有改变的应力诱导^的 Ca ^{2 +}信号的突变体。活细胞^的 Ca ^{2 +}成像设置可适于分析钙使用其他^钙指标内的不同亚细胞区室或在不同类型的细胞离子动力。

Protocol

1，基于水母发光蛋白钙成像使用FAS系统准备苗木发光成像。消毒拟南芥植物表达水母发光蛋白含0.01％的Triton-100 10％的漂白粉溶液的种子。播下含有全强度MS（Murashige和Skoog基础盐混合物），1％蔗糖和1.2％琼脂的无菌种子在方形板（10×10厘米的正方形培养皿格）。代替板垂直地在分层后培养室中于4℃下进行2天（ 图1A）。 转移到苗木电影。在7-10天龄幼苗的生长?…

Representative Results

甘露糖醇，氯化钠和H 2 O 2被用作代理进行脱水，盐和氧化应激刺激，分别。检查，如果重金属离子铜离子协同作用与任何这三个应力刺激，我们比较了的 Ca 2 +响应于在铜离子的存在或不存在各刺激。如示于图2中 ，FAS发光成像显示，Arabidoposis苗反应不同脱水，盐和氧化应激。为刺激我们研究在本研究中的浓度，75mM氯化钠诱导的第40秒的曝光（…

Discussion

我们已经展示了FAS系统记录拟南芥幼苗的时空^钙离子的响应。这FAS ^钙记录系统提供了一个可能被适用于测量通过钙除了在此处提出的非生物胁迫的刺激各种刺激引起^离子动力简便，灵敏，强健的方法。使用这个系统，我们可以很容易地在整株水平比较组织或刺激特定的时空^钙离子动态。 FAS的高灵敏度允许使用低强度刺激的用于检查^的 Ca ^{2 +}的反应?…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
10X10 cm square petri dish	VWR	60872-310
adhesive film	VWR	60941-062
polyethylene tubing	PerkinElmer	9908265
1 mL syringe	VWR	53548-000
silicone grease	Beckman	335148
2-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155379
8-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155409
luminescence imaging system	Princeton Instruments	N/A
inverted confocal laser-scanning microscope	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon A1R
Imaging software	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon Elements
ImageJ	NIH	N/A	Public domain, Java-based image processing program
DataGraph	Visual Data Tools Inc	N/A	DataGraph 3.1.1 is the newest version
coelenterazine	NanoLight Technolgies	#301B NF-BCTZ-FB
All purpose Bleach	Any local store	N/A
Triton X-100	Fisher	BP151500
MS salt	Phytotechnology Labs	M524-50L
sucrose	VWR	BDH8029-12KG
Agar	Sigma	A1296-5KG
Phytagel	Sigma	P8169-1KG