Da Veloce imaging di fluorescenza di Molecular legge Diffusione su membrane cellulare dal vivo in un microscopio commerciale

Carmine Di Rienzo; Enrico Gratton; Fabio Beltram; Francesco Cardarelli

doi:10.3791/51994

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Articolo metodologico

Da Veloce imaging di fluorescenza di Molecular legge Diffusione su membrane cellulare dal vivo in un microscopio commerciale

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DOI:

10.3791/51994

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9 ottobre 2014

Carmine Di Rienzo¹^,² , Enrico Gratton³ , Fabio Beltram¹ , Francesco Cardarelli²

¹NEST Laboratory, Scuola Normale Superiore, ²Center for Nanotechnology Innovation, Instituto Italiano di Tecnologia, ³Laboratory for Fluorescence Dynamics, Department of Biomedical Engineering, University of California, Irvine

In questo articolo

Sommario

La distribuzione spaziale e la dinamica temporale delle proteine e dei lipidi della membrana plasmatica è un argomento caldo in biologia. Qui questo problema è affrontato da un'analisi di fluttuazione dell'immagine spazio-temporale che fornisce concettualmente le stesse quantità fisiche di tracciamento di singole particelle, ma utilizza piccole etichette molecolari e configurazioni di microscopia standard.

Abstract

È diventato sempre più evidente che la distribuzione spaziale e il moto dei componenti della membrana, come i lipidi e le proteine sono fattori chiave nella regolazione di molte funzioni cellulari. Tuttavia, a causa della dinamica veloci e le minuscole strutture coinvolte, risoluzione spazio-temporale molto elevata è necessaria per catturare il reale comportamento delle molecole. Qui vi presentiamo il protocollo sperimentale per lo studio della dinamica delle proteine e dei lipidi plasmatici-membrana fluorescenza marcata nelle cellule vive con alta risoluzione spazio-temporale. In particolare, questo approccio non ha bisogno di tenere traccia di ogni molecola, ma calcola comportamento popolazione utilizzando tutte le molecole in una regione della membrana. Il punto di partenza è una immagine veloce di una regione determinata sulla membrana. Successivamente, una completa funzione di autocorrelazione spazio-temporale è calcolato correlando immagini acquisite ad aumentare i ritardi, per esempio ogni 2, 3, n ripetizioni. E 'possibile dimostrare che la larghezzadel picco dei spaziali aumenti funzione di autocorrelazione al crescente temporizzazione in funzione del movimento delle particelle a causa della diffusione. Pertanto, il montaggio della serie di funzioni di autocorrelazione consente di estrarre la proteina effettiva media cilindrata piazza da immagini (IMSD), qui presentato in forma di apparente diffusività vs spostamento medio. Questo produce una visione quantitativa della dinamica medi delle singole molecole con precisione nanometrica. Utilizzando una variante GFP-tagged della transferrina recettore (TFR) e un ATTO488 contrassegnata con 1-palmitoil-2-idrossi-sn -glycero-3-fosfoetanolamina (PPE) è possibile osservare la regolazione spazio-temporale di proteine e lipidi diffusione su micron-sized regioni membrana nell'intervallo di tempo di micro-to-milli-secondi.

Introduzione

Partendo dal modello originale "mosaico fluido" di Singer e Nicolson, l'immagine di membrana plasmatica cellulare è stato costantemente aggiornato nel corso degli ultimi decenni, al fine di comprendere il ruolo emergente del citoscheletro e lipidi domini ^1,2.

Le prime osservazioni sono state ottenute da recupero fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) svelamento che una frazione significativa di proteine di membrana è immobile ^3-5. Questi studi pionieristici, anche se molto informativo, sofferto dalla relativamente scarsa risoluzione spaziale (micron) e di tempo (secondi) di configurazioni FRAP. Inoltre, essendo un....