خلق تشريحيا دقيقة وقابلة للتكرار داخل الجمجمة Xenografts من أورام الدماغ البشري
Summary
الدماغ هو موقع فريد من نوعه مع الصفات التي ليست ممثلة تمثيلا جيدا من قبل في المختبر أو التحليلات خارج الرحم. نماذج الماوس مثلي مع الموقع ونمو الخصائص استنساخه يمكن إنشاء موثوق مع الحقن داخل الجمجمة باستخدام أداة تثبيت التجسيمي وانخفاض ضغط ضخ حقنة.
Abstract
نماذج ورم مثلي حاليا أفضل طريقة لدراسة خصائص نوع الورم، مع وبدون تدخل، في سياق الحيوانات الحية – وخاصة في المواقع ذات الصفات الفسيولوجية ومعمارية فريدة مثل الدماغ في المختبر ونماذج خارج الرحم لا يمكن. تشكل ميزات مثل الأوعية الدموية، حاجز الدم في الدماغ، والتمثيل الغذائي، والتسليم المخدرات وسمية، ومجموعة من العوامل الأخرى ذات الصلة. نماذج مثلي لها حدودها أيضا، ولكن مع الخلايا السرطانية الأسلوب السليم من الفائدة يمكن المغروسة بدقة في الأنسجة أن معظم كثب الأوضاع في يحاكي الدماغ البشري. من خلال توظيف الأساليب التي توفر كميات قياسها بدقة للتعرف بدقة المواقع بمعدل ثابت والضغط، ونماذج الماوس من أورام الدماغ مع معدلات نمو متوقعة يمكن إنشاء بتكاثر ومناسبة لتحليل موثوق التدخلات المختلفة. بروتوكول الموصوفة هنا يركز على الشركة المصرية للاتصالاتالتفاصيل chnical تصميم والتحضير لحقنة داخل الجمجمة، وإجراء عملية جراحية، وضمان نمو الورم ناجحة وقابلة للتكرار ويوفر نقطة الانطلاق لمجموعة متنوعة من الظروف التي يمكن تخصيصها لمجموعة من نماذج مختلفة ورم في المخ.
Introduction
دراسات في المختبر من خلايا ورم في المخ لا تقدر بثمن للتشريح الآليات الجزيئية دفع عجلة النمو والبقاء، والهجرة، وغزو الخلايا السرطانية. يمكن التجارب خلايا مستنبتة تحديد مسارات إشارات توحي الأهداف العلاجية المحتملة، وتميز استجابة الخلايا للعلاج بالعقاقير. ولكن في المختبر أنظمة بعيدة مبسطة جدا التنبؤ تجاوب عضوي إلى المستحضرات الصيدلانية؛ أنها تفتقر إلى التفاعلات الفسيولوجية، والاستجابات المناعية، المكروية الخلية، وعدم التجانس الكلي للأنظمة الحية الحيوانية. المهندسة وراثيا نماذج لا تقدر بثمن، عندما متاحة، ولكن توجد اختلافات بين الأنواع الجزيئية والخلايا الفئران قد لا ألخص الأحداث في العمليات الإنسانية، مما أدى إلى اختلافات كبيرة عند مقارنة النماذج الحيوانية إلى الملاحظات السريرية 1. نماذج طعم أجنبي الماوس تنطوي تحت الجلد (SQ) حقن خطوط الخلايا ورم الدماغ تحت الجلد من الجهة سهلة لأداءوالتدبير؛ أنها يمكن أن تستخدم لمعالجة آثار التعديل الجيني وإدارة المخدرات / تسليم، والتمثيل الغذائي وسمية. عيوب كبيرة، ومع ذلك، يحد من فائدة نماذج SQ. المكروية لا ألخص ذلك من ورم في المخ التي تحدث بشكل طبيعي: التفاعلات بين مختلف أنواع الخلايا والأنسجة. الأوعية الدموية المحلية، وعوامل أخرى لا تعد ولا تحصى فريد إلى الدماغ لا يمكن تكرارها. لإعادة إنتاج أكثر دقة الوسط فريد من ورم في المخ التي تحدث بشكل طبيعي واختبار تأثير التدخلات الصيدلانية، ينبغي أن تستخدم نموذجا مثلي الماوس. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام تقنيات مثلي كجزء من نهج المعدلة وراثيا التي الخلايا غير السرطانية الأولية الإنسان (التفريق أو السلف) والمعدلة وراثيا وتحقن في الموقع المناسب من الماوس، مع أو بدون خلايا الإنسان سدى، مما أدى إلى تكون الأورام شبيهة بتلك التي شوهدت في البشر 1.
توضح هذه المقالةمنهجية لبدقة وبتكاثر خلق أورام المخ في الفئران. باستخدام هذه التقنية، يمكن للمستخدم حقن بدقة قسامة صغيرة من الخلايا علقت في مكان محدد من المنطقة الجبهي الصدغي الجداري من الماوس القشرة الدماغية. وفيات الماوس منخفضة للغاية. في أيدينا، وقتل أي الفئران من المضاعفات الجراحية بعد 185 إجراءات. يمكن مقارنة خصائص الورم الناتج مع أن الأورام السريرية البشرية نموذجية. على سبيل المثال: سرعة النمو، ودرجة نخر ومدى الغزو، عدم تجانس نوع من الخلايا، ووجود خلايا الإنقسامية، علامات الانتشار وموت الخلايا المبرمج، الخ خطوط الخلايا أو الأنسجة أو ورم العينات البشرية مصنفة ومن ثم يمكن تقييمها على أساس قدرتهم لمحاكاة السريرية الفعلي. المستحضرات الصيدلانية، واختيارهم بناء على أدائهم في زراعة الخلايا، يمكن اختبارها في سياق عملية التمثيل الغذائي سير، ونظام الدورة الدموية، وحاجز الدم في الدماغ لأنها موجودة في خفة دم الحيوان مثقلةهكتار الورم، وكلها في سياق المعمارية ذات الصلة. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا المختارة للحقن يمكن تعديلها وراثيا لتحقيق تأثير الطرح أرضا معينة، والحذف، ضرب الإضافية، والطفرات، وما إلى ذلك على نمو الورم والبقاء على قيد الحياة.
وهناك عدد من المنشورات توثيق الأورام الدراسات باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات داخل الجمجمة. يامادا وآخرون قاموا بدراسة مفصلة للحقن صبغة والخلايا U87، ووجدت أن التقليل من حجم وحقن معدل إنتاج أفضل الورم 2. . بروكس وآخرون جدت استنساخ متفوقة والكفاءة باستخدام محقن المعالجات الدقيقة التي تسيطر عليها بدلا من الطريقة اليدوية لتسليم ناقلات فيروسية. استنتاجاتهم بشأن المعلمات حقن المثلى هي التي تنطبق على تسليم خلية 3. Shankavaram آخرون أظهرت أن ورم أرومي دبقي الأشكال (GBM) خطوط الخلايا حقن orthotopically (باستخدام الطريقة اليدوية) في الدماغ لخص الشخصى التعبير الجيني للCLالأورام inical بشكل أوثق من أي في المختبر أو SQ xenografts، ودعم استخدام نماذج داخل الجمجمة عن الدراسات قبل السريرية 4. جيانيني وآخرون. حقن الخلايا من العينات الجراحية الإنسان التي كانت قد لحقت في جنباته من الفئران عارية من الركض التسلسلي في أدمغة الفئران إضافية، وأظهر أن هذا النهج الحفاظ على المريض تغيرات الجينات السرطانية في النموذج 5. تم الإبلاغ عن نتائج مماثلة من قبل يي وآخرون 6. باستخدام الإعداد التجسيمي، موقع الحقن محددة بعناية، ومعدل الحقن بطيئا ومطردا، التي حصلوا عليها أورام الدماغ استنساخه مع معدلات نمو ثابتة وعالية (100٪) نسبة engraftment. ولذلك فقد تم راسخة في صحة هذه التقنية. ويشير البحث إلى أن الأدب تطبيقات هذه التقنية واسعة النطاق. كارتي وآخرون. تستخدم الحقن داخل الجمجمة لتسليم بنجاح ناقلات فيروسية التعبير عن الجينات العلاجية إلى القشرة الأمامية من transgeniج نموذج من مرض الزهايمر 7. تقي وآخرون وصفت استخدام الحقن داخل الجمجمة لتقديم اتش العلاجي في حال الورم العصبي الخلايا الجذعية الناقل مقرها في الفئران عارية تحمل بالفعل أورام GBM حقن orthotopically 8. بوضوح، والحقن داخل الجمجمة هي أداة مرنة وفعالة للأبحاث ما قبل السريرية. تصف منشورات سابقة في مجلة التجارب تصور النهج الأساسية 9-11، ولكن نأخذ مفهوم حقن الورم داخل القحف والنمذجة مثلي إلى مستوى أعلى من الدقة باستخدام سهلة لإتقان التكنولوجيا.
Protocol
Representative Results
Discussion
نماذج الماوس مثلي من سرطان الدماغ البشري يمكن أن يكون أداة ممتازة لتقييم فعالية العلاجات السريرية، ولكن يجب الحرص على تحسين وضع الخلايا في أنسجة المخ. وقد أظهرت الدراسات أن حجم قسامة المفرطة، تقنية الحقن دون المستوى الأمثل ومعدلات الحقن متسرعة يمكن أن يؤدي إلى التس?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويتم تمويل الدكتور كيتينغ بواسطة CA100335 منحة وزارة الدفاع ومؤسسة هو الباحث القديس Baldrick ل.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Equipment | |||
| Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console. | Kopf | Model 940 | |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 923-B | |
| Mouse Ear Bars | Kopf | Medel 922 | |
| Fiber Optic Illuminator | Fisher | 12-562-36 | |
| UltraMicroPump III | WPI | UMP3 | |
| Micro4 microprocessor | WPI | UMC4 | |
| Variable speed hand-held rotary drill | Dremel | Model 300 | |
| Dental drill bit, 1.0 mm | Spoelting | 514554 | |
| Adaptor for dental drill bit: 3/32 inch collet | Dremel | 481 | |
| Heating pad | for mice | ||
| Isoflurane vaporizer system | for mice | ||
| Medical tubing and connectors | to connect isoflurane vaporizer with stereotaxic frame | ||
| Instruments | |||
| Precision 25 ul micro syringe | Hamilton | 7636-01 | Model 702, without needle |
| Microsyringe needles, 26s gauge | Hamilton | 7804-04 | RN, 25 mm point style 2 |
| Fine-tipped scissors (straight, sharp/sharp) | |||
| Medium-sized standard scissors | |||
| Standard serrated forceps | |||
| Serrated hemostats (2) | |||
| Fine-tipped forceps | |||
| Supplies | |||
| Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon) | MWI | J463G | |
| Surgical blades #10, stainless (Feather) | Fisher | 296#10 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | NDC 13985-528-60 | Item #502017. Liquid inhalation anesthetic. federal law restricts this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| Carprofen (Rimadyl Injectable 50 mg/mL) | Pfizer | NDC 61106-8507-01 | dilute in saline |
| Ophthalmic ointment (artificial tears) | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Topical antibiotic (AK-Poly-Bac ) | Akorn | NDC 17478-238-35 | |
| Povidone-iodine topical antiseptic, 10% (Betadine) | Betadine | NDC 67618-150-04 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | for visualizing skull landmarks |
| Sterile saline | VetOne | NDC 13985-807-25 | for diluting solutions, cleaning tissue |
| Bone wax | WPI | Item #501771 | |
| Sterile drapes | McKesson | 25-517 | |
| Sterile surgical gloves | McKesson | (to fit) | |
| Sterile gauze pads, 2 x 2 | Fisherbrand | 22028556 | |
| Sterile gauze pads, 4 x 4 | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Alcohol prep pads (medium) | PDI | B603 | |
| Sterile cotton-tipped applicators | Fisherbrand | 23-400-114 | |
| Sterile 0.5 ml screw cap tube with caps for cells | USA Scientific | 1405-4700 | for cells |
| Individually wrapped sterile dispo pipettes | Fisher | BD 357575 | for needle cleaning solutions |
| BD insulin syringes with needles | Fisher | 329461 | for analgesic |
| 70% ethanol | for cleaning | ||
| Sterile di H2O | for cleaning | ||
| Microfuge tubes for cleaning solutions | for needle cleaning solutions | ||
| Felt tip pen (dedicated) | for marking skull |
Riferimenti
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nature reviews. Cancer. 10, 470-480 (2010).
- Yamada, S., et al. A method to accurately inject tumor cells into the caudate/putamen nuclei of the mouse brain. The Tokai journal of experimental and clinical medicine. 29, 167-173 (2004).
- Brooks, A. I., et al. Reproducible and efficient murine CNS gene delivery using a microprocessor-controlled injector. Journal of neuroscience. 80, 137-147 (1998).
- Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. Journal of cellular and molecular medicine. 16, 545-554 (2012).
- Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro-oncology. 7, 164-176 (2005).
- Yi, D., Hua, T. X., Lin, H. Y. EGFR gene overexpression retained in an invasive xenograft model by solid orthotopic transplantation of human glioblastoma multiforme into nude mice. Cancer investigation. 29, 229-239 (2011).
- Carty, N., et al. Intracranial injection of AAV expressing NEP but not IDE reduces amyloid pathology in APP+PS1 transgenic mice. PLos ONE. 8, e59626 (2013).
- Thaci, B., et al. Pharmacokinetic study of neural stem cell-based cell carrier for oncolytic virotherapy: targeted delivery of the therapeutic payload in an orthotopic brain tumor model. Cancer gene therapy. 19, 431-442 (2012).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. J. Vis. Exp. (41), (2010).
- Valadez, J. G., Sarangi, A., Lundberg, C. J., Cooper, M. K. Primary orthotopic glioma xenografts recapitulate infiltrative growth and isocitrate dehydrogenase I mutation. J. Vis. Exp. (83), (2014).
- Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- Iwami, K., et al. A novel method of intracranial injection via the postglenoid foramen for brain tumor mouse models. Journal of neurosurgery. 116, 630-635 (2012).
