解剖学的に正確な作成と人間の脳の腫瘍の再現性頭蓋内異種移植片
Summary
脳はよくインビトロまたは異所性の分析によって示されていない資質を持つユニークなサイトです。再現性のある場所および成長特性を有する同所性マウスモデルを確実に定位固定装置及び低圧シリンジポンプを用いて頭蓋内の注射を使用して作成することができる。
Abstract
特に脳のようなユニークな生理学的および建築資質を持つサイトにインビトロおよび異所性モデルができない-同所腫瘍モデルは、生きた動物のコンテキストで、現在で介入することなく、腫瘍の種類の特性を研究するための最良の方法です。そのような血管系、血液脳関門、代謝、薬物送達および毒性、およびその他の関連要因のホストなどの機能を占めている。同所性モデルもそれらの限界を持っているが、関心のある適切な手法腫瘍細胞を正確にはヒトの脳において最も密接に模倣する条件組織に移植することができる。一貫性の速度および圧力で正確に測定された容積を正確に定義するための場所を提供する方法を採用することにより、予測可能な成長速度を有するヒト脳腫瘍のマウスモデルが再現可能に作成され、さまざまな介入の信頼できる分析のために適切であることができる。ここに記載されているプロトコルは、TEに焦点を当てて設計および頭蓋内注射の準備、手術を行うと、成功したと再現性の腫瘍の成長を確保し、異なる脳の腫瘍モデルの範囲に合わせてカスタマイズすることができ、さまざまな条件のための出発点を提供するchnical詳細。
Introduction
脳腫瘍細胞のインビトロ研究は、増殖、生存、遊走、および癌細胞の浸潤を駆動する分子メカニズムを解剖するための非常に貴重である。培養細胞実験は、シグナル伝達経路を定義する潜在的な治療標的が示唆され、薬物治療に対する細胞応答を特徴付けることができる。しかし、in vitroでのシステムは、医薬品への生物の応答を予測するのはあまりにも単純化している。それらは生理的反応、免疫応答、細胞微小環境、および動物生体系の全体的な不均一性を欠いている。臨床観察を1に動物モデルを比較する際の重要な相違をもたらし、人間のプロセス内のイベントを再現しないことが可能な場合、遺伝子操作さのモデルは、非常に貴重なことができますが、分子の違いは種とマウス細胞の間に存在する。脇腹の皮下にヒト脳腫瘍細胞株の皮下（SQ）注射を含むマウス異種移植片モデルは、実行が容易であるおよび測定;彼らは、遺伝子改変および薬物投与/送達、代謝および毒性の影響に対処するために使用することができる。重大な欠点は、しかし、SQモデルの有用性を制限する。微小環境は、天然に存在する脳腫瘍の再現しない：さまざまな細胞型および組織の相互作用を;脳に特有のローカルな血管系、および無数の他の要因は複製することはできません。より正確に、天然に存在する脳腫瘍のユニークな環境を再現し、医薬品介入の効果をテストするには、マウス同所モデルが利用されるべきである。また、同所技術が人間の主要な非癌性細胞（分化した細胞または前駆）遺伝子操作されたアプローチの一部として使用することができる遺伝的に腫瘍形成が生じる、またはヒト間質細胞なしで、マウスの該当部位に変形して注入されるヒトの1に見られるものと同様。
この記事では説明して正確かつ再現性マウスにおいて脳腫瘍を作成するための方法論。この技術を使用して、ユーザは正確にマウス大脳皮質の前頭側頭頂側頭部の指定した場所に懸濁された細胞の小アリコートを注入することができます。マウスの死亡率は極めて低い。私たちの手の中に、全くマウスは185の手順の後に外科的合併症で死亡していない。得られた腫瘍の特性は、典型的なヒト臨床腫瘍のそれと比較することができる。例えば：などの成長速度、壊死の程度、浸潤の程度は、細胞型の異質性、有糸分裂細胞の存在、増殖およびアポトーシスのマーカー、細胞株または脱凝集ヒト組織または腫瘍サンプルは、次にそれらの能力に基づいて評価することができる実際の臨床プレゼンテーションをシミュレートします。それらは動物負担ウィット内に存在するように、細胞培養におけるそれらの性能に基づいて選択された医薬品は、代謝機能、循環系、および血液脳関門の文脈において試験することができるhaの腫瘍、関連する建築のコンテキスト内のすべての。さらに、注射用に選択された細胞は、遺伝的に腫瘍の増殖および生存に対する等の特定のノックダウン、欠失、ノックイン、突然変異の影響を調査するために修飾することができる。
多くの刊行物は、頭蓋内のさまざまな技術を用いて腫瘍の研究を文書化する。 Yamada らは、染料およびU87細胞の注射の詳細な研究を行なったし、最小化する量と噴射率が最高の腫瘍2を生成したことがわかった。 ブルックスらは、マイクロプロセッサ制御式のインジェクタではなく、ウイルスベクターを送達するための手動の方法を使用して、優れた再現性と効率性を発見した。最適噴射パラメータに関する彼らの結論は、細胞送達3にも適用可能である。 Shankavaram らは、多形性膠芽腫（GBM）細胞株を脳内に（手動による方法を使用して）同所注射したことを示したCLの遺伝子発現プロファイルを再現したinical腫瘍がより密接によりインビトロまたはSQ異種移植片において 、前臨床試験4のために頭蓋モデルの使用をサポートする。ジャンニーニらは、追加のマウスの脳内に連続継代によりヌードマウスの脇腹に維持されていた人間の手術標本から細胞を注入し、このアプローチは、モデル5で患者の腫瘍遺伝子変化を保っていることを示した。同様の結果は、李ら 6で報告された。定位セットアップ、慎重に定義注射部位、およびゆっくりと着実な注入速度を使用すると、彼らは一貫性のある成長率と高い（100％）の生着率で再現性の脳腫瘍を得た。この技術の有効性は、したがって、十分に確立されている。文献検索は、この技術の用途は広範囲であることを示唆している。カーティーらは、正常transgeniの前頭皮質中に治療遺伝子を発現するウイルスベクターを送達するための頭蓋内注射を使用アルツハイマー病7のCモデル。サチらは既に同所注入さGBM腫瘍8を担持するヌードマウスに神経幹細胞ベースの担体中に治療的腫瘍溶解性アデノウイルスを送達するための頭蓋内注射の使用を記載している。明らかに、頭蓋内注射は、前臨床研究のための汎用性と効果的なツールです。可視化実験のジャーナル以前の出版物は、基本的なアプローチ9-11を説明し、私たちは簡単にマスター技術を使用して、精度の高いレベルに頭蓋内腫瘍注射と同所モデリングの概念を取る。
Protocol
Representative Results
Discussion
ヒト脳癌の同所性マウスモデルは、臨床治療の有効性を評価するための優れたツールであるが、脳組織内の細胞の配置を最適化するために注意しなければならないことができる。腫瘍の大きさの研究過度のアリコート量、準最適な注入技術及び性急な注入速度が漏出し、望ましくない場所での腫瘍細胞の出現をもたらし得ることが示されている（脳室、脊髄、硬膜外の領域など ）と高…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
博士はキーティングは、DODのグラントCA100335によって資金を供給し、聖剣帯の財団奨学生です。
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Equipment | |||
| Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console. | Kopf | Model 940 | |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 923-B | |
| Mouse Ear Bars | Kopf | Medel 922 | |
| Fiber Optic Illuminator | Fisher | 12-562-36 | |
| UltraMicroPump III | WPI | UMP3 | |
| Micro4 microprocessor | WPI | UMC4 | |
| Variable speed hand-held rotary drill | Dremel | Model 300 | |
| Dental drill bit, 1.0 mm | Spoelting | 514554 | |
| Adaptor for dental drill bit: 3/32 inch collet | Dremel | 481 | |
| Heating pad | for mice | ||
| Isoflurane vaporizer system | for mice | ||
| Medical tubing and connectors | to connect isoflurane vaporizer with stereotaxic frame | ||
| Instruments | |||
| Precision 25 ul micro syringe | Hamilton | 7636-01 | Model 702, without needle |
| Microsyringe needles, 26s gauge | Hamilton | 7804-04 | RN, 25 mm point style 2 |
| Fine-tipped scissors (straight, sharp/sharp) | |||
| Medium-sized standard scissors | |||
| Standard serrated forceps | |||
| Serrated hemostats (2) | |||
| Fine-tipped forceps | |||
| Supplies | |||
| Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon) | MWI | J463G | |
| Surgical blades #10, stainless (Feather) | Fisher | 296#10 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | NDC 13985-528-60 | Item #502017. Liquid inhalation anesthetic. federal law restricts this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| Carprofen (Rimadyl Injectable 50 mg/mL) | Pfizer | NDC 61106-8507-01 | dilute in saline |
| Ophthalmic ointment (artificial tears) | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Topical antibiotic (AK-Poly-Bac ) | Akorn | NDC 17478-238-35 | |
| Povidone-iodine topical antiseptic, 10% (Betadine) | Betadine | NDC 67618-150-04 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | for visualizing skull landmarks |
| Sterile saline | VetOne | NDC 13985-807-25 | for diluting solutions, cleaning tissue |
| Bone wax | WPI | Item #501771 | |
| Sterile drapes | McKesson | 25-517 | |
| Sterile surgical gloves | McKesson | (to fit) | |
| Sterile gauze pads, 2 x 2 | Fisherbrand | 22028556 | |
| Sterile gauze pads, 4 x 4 | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Alcohol prep pads (medium) | PDI | B603 | |
| Sterile cotton-tipped applicators | Fisherbrand | 23-400-114 | |
| Sterile 0.5 ml screw cap tube with caps for cells | USA Scientific | 1405-4700 | for cells |
| Individually wrapped sterile dispo pipettes | Fisher | BD 357575 | for needle cleaning solutions |
| BD insulin syringes with needles | Fisher | 329461 | for analgesic |
| 70% ethanol | for cleaning | ||
| Sterile di H2O | for cleaning | ||
| Microfuge tubes for cleaning solutions | for needle cleaning solutions | ||
| Felt tip pen (dedicated) | for marking skull |
Riferimenti
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nature reviews. Cancer. 10, 470-480 (2010).
- Yamada, S., et al. A method to accurately inject tumor cells into the caudate/putamen nuclei of the mouse brain. The Tokai journal of experimental and clinical medicine. 29, 167-173 (2004).
- Brooks, A. I., et al. Reproducible and efficient murine CNS gene delivery using a microprocessor-controlled injector. Journal of neuroscience. 80, 137-147 (1998).
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- Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro-oncology. 7, 164-176 (2005).
- Yi, D., Hua, T. X., Lin, H. Y. EGFR gene overexpression retained in an invasive xenograft model by solid orthotopic transplantation of human glioblastoma multiforme into nude mice. Cancer investigation. 29, 229-239 (2011).
- Carty, N., et al. Intracranial injection of AAV expressing NEP but not IDE reduces amyloid pathology in APP+PS1 transgenic mice. PLos ONE. 8, e59626 (2013).
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- Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme. J. Vis. Exp. (67), (2012).
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