Summary
Brain myeloidceller karakterisering efter stroke kan utföras med stereology med den optiska fraktioneringsmetod, eller genom en flödescytometrianalyser av hjärnan leukocyter suspensioner. Båda är användbara tekniker för att utföra en korrekt fenotypiska skillnaden av de viktigaste myeloida cellgrupper som finns i den ischemiska hjärnan.
Abstract
Mikroglia aktivering, samt extravasation av hematogen makrofager och neutrofiler, tros spela en central roll i hjärnskada efter stroke. Dessa myeloida cellsubpopulationer kan visa olika fenotyper och funktioner och kunna särskiljas och karakteriseras att studera deras reglering och bidrag till vävnadsskador. Detta protokoll ger två olika metoder för hjärnan immunceller karakterisering: en exakt stereologisk strategi och en flödescytometrisk analys. Den stereologisk strategi bygger på den optiska fraktioneringsmetod, som beräknar det totala antalet celler i ett område av intresse (infarkt hjärnan) uppskattas genom en systematisk stickprov. Den andra karakterisering metod ger ett enkelt sätt att isolera hjärn leukocyt upphängningar och karakterisera dem med flödescytometri, vilket möjliggör karakterisering av mikroglia, infiltrerade monocyter och neutrofiler i ischemisk vävnad. Dessutom är det också details en cerebral ischemi modell hos möss som enbart påverkar hjärnans cortex, genererar mycket reproducerbara infarkter med en låg dödlighet, och förfarandet för histologisk hjärn behandling för att karakterisera infarktvolym av Cavalieri metoden.
Introduction
Morfologiska, fenotypiska och genuttryck förändringar av mikroglia, liksom extravasering och aktivering av hematogen makrofager och neutrofiler tros spela en central roll i den patofysiologiska kaskad efter hjärnskada 1-4. Detta protokoll ger två metoder för att uppskatta antalet olika myeloid cellgrupper av den ischemiska hjärnan och att utföra sina fenotypiska karaktärisering. Dessutom ger det också en beskrivning av en experimentell modell av cerebral ischemi i möss, som består av övergående eller permanent ligering av både distala Arteria cerebri media (MCA) och den gemensamma halspulsådern (CCA), inklusive hur man utvärdera infarkt genom noggrann Cavalieri metoden i ett stereologisk mjukvara.
Den första metoden att karaktärisera myeloida cellgrupper av ischemisk hjärnan är en stereologisk metod baserad på den optiska fraktionatorn tillvägagångssätt 5. Detta är det mestvanligen används stereologisk sond i biovetenskap och ger en hög grad av precision med låga koefficienter för fel 5-7. Detta är det bästa valet för cell kvantifiering när vävnaden skärs i sektioner, eftersom den undviker bias på cell uppskattning på grund av fragmenteringen av vävnaden i sektioner. Denna metod är ett mycket kraftfullt sätt att karakterisera siffror, dynamik och fenotypiska förändringar av infiltrerade neutrofila subpopulationer av den ischemiska vävnaden 8.
Den andra karakterisering strategi bygger på ett modifierat protokoll från Campan och medarbetare 9 som ger ett enkelt sätt att isolera hjärn leukocyt upphängningar och karakterisera dem med flödescytometri. I motsats till konventionella immunhistokemiska tekniker, flödescytometri karakterisering tillåter differentiering mellan mikroglia (CD45 lo CD11b +) och infiltrerade myeloidceller (CD45 hi CD11b +) baserat på deras difftekniker när expressionsnivåer av CD45 9-13. Dessutom proinflammatoriska monocyter (CD45 hi CD11b + Ly-6G - Ly-6C hi), neutrofiler (CD45 hi CD11b + Ly-6G +) och andra leukocyter delmängder av den ischemiska vävnaden kan urskiljas. Denna metod ger en tillförlitlig och snabb analys för att bedöma neuroinflammation i experimentella modeller av hjärnischemi. Emellertid kan vävnadsbehandling påverka aktiveringstillstånd och numren på de olika cellpopulationer som finns i den ischemiska vävnaden tillhandahåller en semi-kvantitativ karakterisering.
Protocol
OBS: Alla försöksprotokoll anslutit sig till riktlinjerna för djurskyddskommitté Universidad Complutense (efter EU-direktiv 86/609 / CEE och 2003/65 / CE).
1. cerebral ischemi Model
OBS: Den cerebral ischemi modellen i detta dokument innefattar permanent eller övergående ocklusion av både CCA (gemensamma halspulsådern) och MCA (mellersta cerebral artär) genom ligering med en nylonsutur.
- Pre-kirurgiska preparat
- Sterilisera alla kirurgiska instrument genom autoklavering eller med en glaspärla autoklav. Desinficera kirurgiska området med 70% etanol samt.
- Söva musen med lämpliga anestetika. Uppnå induktion med isofluran 2,5% och underhålla med med isofluran 1,5% i en blandning av 80% luft / 20% syre med hjälp av en förångare. Applicera artificiella tårar till möss ögonen för att förhindra torrhet under narkos.
- Placera musen på en värmedyna som är kopplad till en avgiftdback enhet med en temperatursond placerades i ändtarmen och inställd temperatur vid fysiologiska nivåer (36,5 ± 0,5 ° C) under den kirurgiska proceduren.
- Vanliga karotid artärocklusion genom ligering
- Placera musen i rygg VILA och immobilisera med tejp. Desinficera huden med 70% etanol eller povidon-jodid och klippa håret på den övre ventrala delen.
- Under ett operationsmikroskop, gör en 1 cm mittlinjesnitt runt den ventrala ytan av halsen.
- Dra isär alla mjukdelar (körtelvävnad inklusive mandibular-, sublingual och parotideallymfknutorna körtlar) och identifiera den vänstra gemensamma halspulsådern (CCA), som är lokaliserad i sidled till luftstrupen. Dra in musklerna och exponera vänster CCA. Dissekera försiktigt från vagusnerven.
- När dissekeras, ockludera den vänstra CCA genom en ligatur med användning av en 6/0 nylonsutur. Ligera med en permanent knut eller en slipknot (att tillåta reperfusion om en övergående cerebral ischemi modellen önskas).
- Placera körtelvävnad i sitt ursprungsläge och stäng snitt på halsen huden med en 6/0 nylonsutur.
OBS: Sham djur utsätts för samma kirurgiska ingrepp som kortex djur men CCA inte tilltäppt.
- Distal mitten cerebral artär ocklusion genom ligering
- Placera musen på sin högra sida och immobilisera med tejp. Desinficera skinnet på huvudet med 70% etanol eller povidon-jodid och klippa håret på musens huvud (ta bort hår efter styckning).
- Under ett operationsmikroskop, gör ett snitt i huden mellan ögat och örat. Flytta huden bort och håll den med tejp.
- Gör ett horisontellt snitt om tids muskeln från höger till vänster. Gör sedan en andra vertikal snitt på höger sida av tids muskeln (vara noga med att undvika cut temporal ven). Dra isär den temporala muskeln från skallen och håll den med en sutur för att upprätthålla en ren skalle yta.
- Rengör skallen ytanmed kall steril saltlösning för att detektera den exakta positionen för den vänstra Arteria cerebri media (MCA) via skallen öppenhet. Utför en rund kraniotomi (1 mm i diameter) med en rostfri burr i frontalloben mellan zygomatic båge och squamosal benet. Ta försiktigt skallen och exponera MCA.
- Applicera en liten mängd kall steril koksaltlösning på ytan av hjärnan och avlägsna hjärnhinnorna (dura och spindelvävshinnan mater) genom användning av pincett.
- Utför ligering av den vänstra MCA i distala stammen strax före bifurkationen mellan främre och bakre MCA grenar. Ockludera den vänstra MCA med en ligatur med användning av en 9/0 nylonsutur. Ligera med en permanent knut eller en slipknot (att tillåta reperfusion om en övergående cerebral ischemi modellen önskas). Tidsperioden mellan CCA och MCA ocklusion är ca 10-20 minuter beroende på operatörens erfarenhet.
- Placera den temporala muskeln till sitt ursprungsläge och stäng incision på halsen huden med en 6/0 nylonsutur.
- Återgå musen till buren för att återhämta sig från anestesi (vanligen 5-10 min) och injicera musen med buprenorfin intraperitoneal (IP) (0,3 mg / kg).
- Övervaka musen för flera timmar för att upptäcka eventuella obehag (inte lämnar musen utan tillsyn tills den har återfått tillräckligt medvetandet att upprätthålla sternala VILA). Eftersom postoperativ vikt förlorade observeras i allmänhet, placera mosade mat i en petriskål för att underlätta att äta.
- När djuret är helt återhämtat sig, tillbaka till företaget för andra djur.
- Om en transient kortex modell önskas, söva musen igen och ta bort slipknot av CCA och MCA att tillåta reperfusion (vanligtvis mellan 0,5-2 tim (Figur 1)).
OBS: Sham djur utsätts för samma kirurgiska ingrepp som kortex djur men MCA är inte blockerad.
2. Perfusion och avsoning av hjärnvävnad
- 24 eller 48 timmar efter MCAO, offra musen med en dödlig dos av narkosmedel (t.ex. natrium pentobarbital, IP 86 mg / kg eller en överdos med isofluran).
- BEGJUTA musen med fosfatbuffert 0,1 M, följt av 4% paraformaldehyd (PFA) i fosfatbuffert (pH 7,4).
- Ta hjärnan enligt följande:
- Halshugga djuret strax ovanför ryggmärgen.
- Gör en posterior-anterior snitt på huvudet hud för att exponera skallen. Gör två laterala snitt vid korsningen av sidoväggarna och basen av skallen och ta bort den lilla bit av ben.
- Skär ett snitt genom skallen längs den sagittala suturen.
- Ta skallen liggande varje hemisfär med hjälp av en pincett för att exponera hjärnan. Använd en spatel för att separera hjärnan från skallen och överför denna till 4% PFA-lösning.
- Post-fix för 3 timmar i 4% PFA-lösning vid 4 ºC.
- Ta bort PFA-lösning och incubate hjärnan under 48 timmar i 30% sackaros lösning cryoprotect hjärnan.
- Ta sackaroslösning och frysa hjärnan snabbt i kallt isopentan (-40 ºC). Store frysta hjärnan vid -80 ºC.
- Skaffa koronala hjärnan sektioner (30 nm) med en frys mikrotom. Samla tio seriella uppsättningar i en kryokonserveringsmedel lösning. Varje serieuppsättning består av cirka 14-16 koronala skivor med en snitten avstånd av 300 pm som på ett tillfredsställande prov musen hjärnan mellan 1,94 och -2,46 posteriort bregma.
3. Nissl färgning och infarktvolymen Uppskattning
- Nissl färgning av kresylviolett
- Mount hjärnsektioner i en Superfrost objektsglas. För infarktvolym bestämning av Cavalieri metoden Nissl-färgade sektioner, använd en 1/20 slice-sampling fraktionen (1/2 delar av en av de tio serie uppsättningar som samlats in i steg 2,7, ungefär, totalt antal 7-8 sektioner med en snitten avstånd av 600 μ; M används). Var noga med att upprätthålla god anterior-posterior riktning (infarktområdet placeras på höger sida).
- Utför konventionell Nissl färgning enligt följande:
- Tillåt glidmonterade sektioner torka flera timmar.
- Rehydrera glidmonterade sektioner och färgas med 0,1% kresylviolett lösning för 5 min.
- Dehydrera med en graderad serie av EtOH (70%, 90%, och 100%; 5 min per förändring). Rengör glidmonterade sektioner med xylen, till distrene-80 mjukgörare xylen (DPX) monterings medier och täck med ett täckglas.
- Använda stereologisk mjukvara för att uppskatta infarktvolymen med Cavalieri metoden Nissl-färgade seriella sektioner
- Använd parametrar som visas i tabell 1 att kvantifiera infarktvolym av Cavalieri metoden 14 och ett stereology system, som består av ett mikroskop utrustat med en kamera, en XYZ motoriserade dator skede och stereologisk mjukvara (Huvudanvisningarna nedan är relaterade till datorer men instruktionerna kan skilja för andra operativsystem).
- Slå på datorn, mikroskop, etapp controller och kamera i rätt ordning. Starta stereologisk programvara.
- Flytta 10X objektivet på plats och välj 10X från objektivt rullgardinsmenyn.
- Flytta runt den första Nissl fläckade sektionen och hitta en lämplig referenspunkt. Klicka med musen för att fastställa referenspunkten (att flytta runt det är nödvändigt att aktivt glädjen fri knappen).
- Uppskatta "monterad snittjocklek" (det faktiska snittjocklek med hänsyn tagen till krympning). Tryck på "Focus Position Meter" -knappen och beräkna tjockleken från botten till toppen av sektionen.
- Skapa ett konturverktyg för contralesional och ipsilesional utrymmen och infarktområdet.
- Klicka på menyn "Display" och välj "Bildskärmsinställningar". Detta öppnar tHan Display Inställningar Dialog.
- Välj fliken "konturer" och klicka på knappen "Lägg Contour typ".
- Skapa en kontur för varje region att kvantifiera och göra dem synliga i konturen menyn. Klicka på OK.
- Skapa en Marker verktyg för contralesional och ipsilesional halvklot och infarktområdet.
- Klicka på menyn "Display" och välj "Bildskärmsinställningar" för att öppna dialogrutan Bildskärmsinställningar det.
- Välj fliken "Markers" och ändra markörerna namn genom att dubbelklicka över de tillgängliga markörer. Gör dem synliga i Marker Bar. Klicka på OK.
- Aktivera sektionschef.
- Klicka på menyn "Verktyg / Serial sektionschef". Lägg till ett nytt avsnitt med "nya avsnittet" -knappen. Denna knapp öppnar "dialogen Serial Avsnitt Setup" på.
- Ställ "Blockera Advance" som 30 nm. Ställ"Monterade snittjocklek" med värdet uppskattas i steget 3.2.5.
- Ställ "Utvärdering Interval" som 20. Använd en 1/20 skiva samplings fraktion.
- Set "startsektionen nummer" som 1. Ställ "Z-axelvärde för toppen av den första sektionen" som 0. Klicka på OK.
- Rita en kontur för att beskriva den kontralaterala hemisfären.
- Välj Contralesional halvklotet verktyget (tidigare skapade i steg 3.2.6) från konturen menyn.
- Rita en kontur för att beskriva den kontralaterala hemisfären.
- För att avsluta spåra contralesional halvklotet, högerklicka med musen och välj "nära kontur".
- Uppskatta contralesional halvklotet konturen av Cavalieri.
- Klicka på menyn "Probes" och välj Cavalieri Estimator. Ställ "Grid Mellanrum" som 100 nm. Ställ "Grid Rotation" som 0. Ställ "Blås Advance ", som 30 ^ m. Klicka på OK.
- Välj "Den contralesional halvklotet" knappen från Markörer Bar. Högerklicka inuti Contralesional halvklotet konturen.
- Välj "Paint Cavalieri Markers Mode". Högerklicka inuti contralesional halvklotet konturen igen och välj "Paint Markers till Contour".
- Avaktivera Cavalieri Estimator genom att klicka på prober och Cavalieri Estimator och avaktivera contralesional markeringsknappen från markören fältet.
- Upprepa samma procedur för ipsilesional halvklotet och infarktområdet (steg 3.2.7 och 3.2.8). Spara data efter uppskattningen av området av varje avsnitt.
- Beräkna kontra, ipsilesional och infarcerade områden i resten av Nissl-färgade avsnitt.
- Skapa ett nytt avsnitt som i steg 3.2.6. Ändra inte de värden som anges i "Serial avsnittet Inställningar" dialogrutan. Klicka på Ok.
- Upprepa steg 3.2.7-3.2.8 i det nya avsnittet.
- Exportera resultatet av kvantifiering till ett kalkylblad.
- Klicka på "Probes" i Stereo Investigator menyn. Välj "Display Probe Run List". Detta öppnar "Föregående stereologisk Runs Dialog".
- Välj alla avsnitt genom att klicka över dem. Tryck på "Visa resultat" knappen. Detta öppnar "Cavalieri Estimator Resultat" när det uppskattade area och volym för varje region visas.
- För att exportera resultaten till ett kalkylblad, klicka på "Kopiera alla resultat till Urklipp" och klistra in till en Excel-fil med de viktigaste resultaten från varje region (tabell 2).
- Express infarktvolym som mm 3 eller som% av halvklotet som är infarkt (% IH) med formeln 15% IH = InfVol / ContrVol * 100, där
ContrVol (Contralesional halvklotet Volym) = ΣContrArea jag
4. stereologisk Kvantifiering av infiltrerat neutrofiler Efter cerebral ischemi av optiska Fraktionator
- Färgning av hjärnan sektioner:
- För att uppskatta det totala antalet infiltrerade neutrofiler efter kortex av den optiska fraktionerings 16, använd en 1/10 skiva samplings fraktion. Immunostain neutrofiler med hjälp av konventionella immunofluorescenstekniker med råtta anti-Ly6G antikropp (1A8) och den högra sekundär antikropp på fritt flytande sektioner. Dessutom, en motfärgning med en nukleär kare som DAPI eller TOPRO, även om det inte är nödvändigt för neutrofil identifiering, kan göra det lättare att upptäcka infarktområdet.
- Mount hjärnsektioner i en Superfrost objektsglas med infarktområdet placeras i den högra sidan.
- Quantification av infiltrerade leukocyter i ischemiska hjärnan genom den optiska fraktionatorn
- Använd parametrar som visas i tabell 3 att kvantifiera infiltrerade leukocyter i den ischemiska hjärnan genom den optiska fraktionatorn tillvägagångssätt med ett stereology system. Upprepa stegen 3.2.1-3.2.5 från avsnitt 3.
- Skapa en konturverktyg för infarktområdet som det har beskrivits i steg 3.2.6 i avsnitt 3.
- Skapa en markör verktyg för neutrofiler som det har beskrivits i steg 3.2.7 i avsnitt 3.
- Aktivera sektionschef och skapa ett nytt avsnitt som i steg 3.2.8. I detta fall in "Utvärdering Interval" som 10 (a 1/10 skiva provtagnings fraktionen används för att uppskatta neutrofila nummer).
- Välj "infarktområdet" konturverktyg (tidigare skapade i steg 4.2.1) från konturen menyn. Rita en kontur för att beskriva infarktområdet vid 10X objektiv. Ändra målet att 100X att utföra neutrophil kvantifiering (glöm inte att välja 100X från objektivrullgardinsmenyn).
- Klicka på menyn "Probes" och välj "Optical Fraktionator". Ställ "XY Placering av räkna Frames" som 230 för både X och Y rutnät storlek. Ställ "Grid Rotation" som 0. Ställ in "Block Advance" som 30 nm. Klicka på OK.
- Välj "neutrofila" -knappen från Marker Bar. Mark färgade neutrofiler i infarktområdet. När finish, inaktivera den optiska Fraktionator sonden genom att klicka på "Probes" och "Optical Fraktionator". Avaktivera neutrofila knappen från markören fältet.
- Upprepa samma procedur för varje avsnitt (4.2.4-4.2.9).
- Exportera resultatet av kvantifiering till ett kalkylblad.
- Klicka på "Probes" i Stereo Investigator menyn. Välj "Visa Probe Run List" för att öppna "Tidigare stereologisk Runs"dialogrutan.
- Välj alla avsnitt genom att klicka över dem. Tryck på "Visa resultat" knappen för att öppna "de optiska fraktionator Resultat" där det uppskattade antalet neutrofiler visas.
- Exportera resultatet till ett kalkylblad genom att klicka på "Kopiera alla resultat till Urklipp" och klistra in till ett kalkylblad.
5. Brain Dissociation och flödescytometrianalys
OBS: myeloisk subpopulationen karakterisering genom flödescytometri på färsk hjärnvävnad kan användas som ett alternativ till den föregående neutrofil karakteriseringen utförs på fasta och immunfargades hjärnsektioner.
- Brain dissociation och encellssuspension förberedelser
- Gör 10 ml / djur av en RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium) -Percoll lösning innehållande 8 ml RPMI, 1 ml av 30% Percoll och 1 ml av en 10x PBS (fosfatbuffrad saltlösning).
- REFlytta mushjärna efter MCAO som beskrivs i steg 2.3.
- Under ett mikroskop, dissekera ut core och peri-infarktområden ipsilaterala kortex från hjärna ischemisk mus (eller en liknande region för falskt och naiva djur) från hjärnan. Vikt hjärnvävnad och placera den i 5 ml iskall RPMI-Percoll (den viktklassen kan utföras för normalisering mellan experimentella grupper).
- Dissociera vävnaden i en enda cell suspensionen med Potter-Elvehjem-vävnadstyp kvarn med Teflon pestles.
- Överför cellsuspensioner till en 50 ml ultracentrifugrör och tillsätt ytterligare 5 ml RPMI-Percoll-lösning till proverna.
- Centrifugera cellsuspensioner vid 7800 xg under 30 min vid 25 ° C. Efter centrifugering, säkerställa en vitfärgad skiktet motsvarar myelin visas överst av lösningen.
- Avlägsna myelinskiktet noggrant och filtrera hela cellsuspensioner, inbegripet de pelleterade cellerna, genom 40-xm nylonnät strainer.
- Tillsätt 10 ml RPMI på silen för att säkerställa att alla celler är filtrerade och placera lösningen i ett 50 ml rör. Tillsätt 30 ml RPMI och centrifugera 50 ml cellsuspension vid 600 xg under 10 min vid RT.
- Kasta bort supernatanten och suspendera leukocyter pelleten med 1 ml PBS. Lägg 4 ml lyseringsbuffert (150 mM NH4CI, 10 mM NaHCOs 3 och 0,1 mM EDTA) och inkubera cellerna under 2-3 min vid RT för att lysera erytrocyter från cellsuspensionen. Centrifugera lösningen vid 600 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Cellfärgning och flödescytometri
- Förbered en märkning cocktail för flödescytometri, innehållande 200 pl PBS-BSA (1%) 1: 100 Fc-Block, 01:40 anti-CD45-PerCP råtta, 01:40 anti-Ly6G-APC råtta, 01:40 anti CD11b-FITC råtta och 01:40 anti-Ly-6C-PE råtta per prov.
- Resuspendera cellerna i märkning cocktail och inkubera proverna under 45 minuter i is.
- Tvätta märkningen cocktailmed 1 ml kall PBS och centrifugera cellerna vid 600 xg under 10 min vid 4 ° C. Resuspendera pelleten med 100 | il FACS Flow och förvärva hela cellsuspensionen med flödescytometri.
- Använd en flödescytometrianalys programvara för att karakterisera och kvantifiera cellpopulationer.
- Huvud leukocyter delmängder motsvarande märkning cocktail framställts i detta protokoll kan karakteriseras enligt följande: CD45 lo CD11b +: bosatta mikrogliaceller; CD45 hej CD11b + Ly-6G +: neutrofiler; CD45 hej CD11b + Ly-6G - Ly-6C hi: proinflammatoriska monocyter.
Representative Results
Den cerebral ischemi modellen visas här genererar infarkter sett uteslutande i cortex utan att påverka striatal vävnad eftersom lenticulostriatal grenar av MCA som vattna striatum inte tilltäppt (Figur 1). Genom Nissl färgning, kan det skadade området identifieras som ett hypochromic kortikal område (Figur 2). Denna modell kännetecknas av högt reproducerbara infarkt volymer vid 24 timmar efter MCAO (% IH 15.89 ± 0,28) uppskattas av Cavalieri metod Nissl-färgade sektioner (Figur 2). Uppskattning av infarktvolymen med Cavalieri metoden är en noggrann metod med en låg fel som återspeglas i koefficienten för fel (CE) av Gundersen i contralesional och ipsilesional hemisfärer liksom i infarktområdet (Tabell 2). Skadad vävnadsvolym kan uttryckas i mm 3 men också som% IH med hjälp av formeln i avsnitt 3.2.13. Dessutom uppskattningenav den totala volymen av de ipsilesional och contralesional regionerna medger för beräkningen av ödemindex för att korrigera infarktvolymen och för att undvika en överskattning av den skadade vävnaden (tabell 2).
Med tanke på den seriella sektione behandlingen av hjärnvävnad, kan detta tas tillvara för att utföra en noggrann uppskattning av det totala antalet cellsubpopulationer, liksom infiltrerade neutrofiler, i ischemiska området, genom att använda den optiska Fraktionator strategi (Figur 3 och tabell 4) med parametrar som visas i tabell 3. uppskattar Detta protokoll ett totalt antal av neutrofiler (Ly6G-positiva celler) i infarktområdet av 23328 ± 3623 vid 24 h och 82856 ± 8143 vid 48 h i möss efter pMCAO (Figur 3D). I överensstämmelse med tidigare studier, är neutrofil infiltration direkt korrelerad med infarktstorlek (figur 3E). Uppskattning av tHan antal neutrofiler genom optiska Fraktionator metoden är en exakt metod med låg fel som reflekteras av CE av Gundersen (tabell 4).
Den leukocyt isolering och flödescytometri karakterisering protokoll möjliggör isolering av 47.922 ± 23.174 myeloida celler från cortex av ipsilesional hemisfären av ischemiska möss. Detta omfattar 10-30% av de som finns i cellsuspensionen totala händelser. Den stora majoriteten av infångade händelser som använder detta protokoll närvarande låg FSC parameter, associerad med cellrester (Figur 4). CD11b färgning visar att CD11b + celler har en högre FSC värde (Figur 4), vilket tyder på att cellrester inte är märkt med denna markör och, som tidigare angivits, att det kan uteslutas från vidare analys genom att sätta tröskeln FSC vid 200 9. Den varierande mängd cellfragment som erhålls med denna metod antyder att skillnader på prov processning (timing, bevarande vävnad, provtemperatur, effektiv myelin borttagning, etc.) kan stå för det. Dessutom behövs också användningen av cell silar för att undvika förekomst av cellulära klämmor i proven; detta steg behöver göras före cellfärgning. Använda gating strategi som visas i Figur 5, som är baserad på CD11b och CD45 uttryck, kan vi skilja mellan inhemska och infiltrerade myeloida celler i ischemisk vävnad. Detta CD11b + befolkningsökningar i ischemisk halvklotet jämfört med naiva och med skengruppen, där dessa celler oftast associeras till en låg uttryck för CD45 indikerar att mikroglia frodas efter ischemi (Figur 4, Figur 5 och Tabell 5) . Denna skillnad beror sannolikt på cellinfiltration från periferin, vilket bevisas av utseendet på en CD11b + CD45 hej cell subpopulationer i den ischemiska hjärnan (fig 4, Figur 5 och tabell 5) vilket är lågt antal i naiva och i sken hjärnor. Bidrag infiltrat till CD11b + cellpopulationen i hjämischemi är en mycket dynamisk process 4. I kortex modellen genom ligatur, kan det variera från 30% till 60% av de totala CD11b + celler beroende på storleken av lesionen och om den tid när karakteriseringen har gjorts. Neutrofiler, karakteriserade som Ly-6G + celler, är de mest talrika infiltrerade cellpopulation finns på 24 timmar efter MCAO i ischemisk mus hjärnan med hjälp av denna modell av cerebral ischemi, eftersom de omfattar 70-80% av CD11b + CD45 hej. Resten av cellerna är mestadels en subpopulation av CD 11 b + CD45 hi Ly-6G - Ly-6C hi proinflammatoriska monocyter. I denna modell kommer denna population ökar i antal i de ischemiska hjärnområden 24-48 timmar efter MCAO.
Figur 1:. Kirurgiskt förfarande för MCA ligering (A) Efter tillbakadragning av den temporala muskeln, är en liten kraniotomi utfördes i mus skallen. MCA ligeras med en knut eller en slipknot med hjälp av en 9/0 sutur. (B) Representativa bilder av den kortikala lesion genereras av kortex modellen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Kvantifiering av infarktvolymen med Cavalieri. (A) Representativa bilder av Nissl-färgade hjärnsektioner 24 timmar efter permanenta MCA ligation. Den höga förstoringen visar hipocromatic området efter Nissl färgning somidentifierar det skadade området (core) efter kortex. Den Peri infarkt (PI) region visas också. (B) Kvantifiering av infarktvolym representerade som% infarkt Hemisphere (% IH) med hjälp av Cavalieri metoden i serie Nissl-färgade sektioner, 24 timmar efter MCAO (n = 50 möss ).
Figur 3: stereologisk kvantifiering av neutrofiler i infarktområdet 24 och 48 timmar efter ligation, med hjälp av optiska Fraktionator metoden. (A) representant bild av infiltrerade neutrofiler (Ly6G-positiva celler) i det ischemiska området vid 24 timmar efter MCAO. Avgränsning visar infarktområdet. (B, C) Exempel på en optisk dissektorn för neutrofil kvantifiering av den optiska fraktionatorn. (D) Kvantifiering av totala neutrofiler i infarktregionen vid 24 och 48 h (n = 4 möss). (E)Korrelation av antalet neutrofiler med infarktstorleken vid 24 och 48 timmar efter MCA ligation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Representativa dot-plot scatter analys av hjärn leukocyter erhölls från naiva, sham och ischemisk (24 h efter MCAO) hemisfärer på grundval av de fysiska parametrarna (SSC och FSC) En population av händelser som uttrycker CD11b (röd) identifierades i samtliga grupper. Denna population var gated och kännetecknas enligt uttrycket av CD45. Celler som uttrycker låga halter av CD45 (grön) var närvarande i den ischemiska och icke-ischemiska hjärnbark och motsvarade mikrogliaceller. I motsats, celler som uttrycker höga nivåer av CD45 (gul) var endastfinns i den ischemiska hemisfären och i mindre utsträckning i simulerad grupp. Ytterligare analys av CD11b + CD45 hej befolkningen visar att neutrofiler (Ly-6G + celler, blå) och pro-inflammatoriska monocyter (Ly-6C hi celler, orange) är de viktigaste cellsubpopulationer finns i hjärnan infiltrerar 24 timmar efter stroke. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. Slussning strategier för att skilja bosatta från infiltrerade myeloida celler i ischemisk vävnad CD11b + celler var först gated enligt isotyp fluorescensintensitet (A). Ett representativt punktdiagram för cellsuspensioner av ischemisk hjärnan visas i upp till höger på panelen. IDessutom typiska värden för det totala antalet händelser och för antalet CD11b + händelser som förvärvats med hjälp av denna teknik visas (ingen av celler / ischemisk hjärnhalvan;. (A) CD45 Fluorescens intensitetsanalys av CD11b + celler visas i panelen B. En representativ punktdiagram analys av CD45 och CD11b uttryck för gated CD11b + subpopulation visas i upp till höger på panelen. Dessutom typiska antalet CD45 lo CD45 hi celler som förvärvats per ischemisk hjärnhalvan med den här tekniken visas (B).
| Parametrar som används för Cavalieri metod | |
| Avsnitt Tjocklek (t) | 30 | im |
| Syfte | 10X |
| Slice provtagning fraktion (SSF) | 1/ 20 |
| Avstånd mellan sektionerna | 600 | im |
| Grid Mellanrum | 100 | im |
Tabell 1: Parametrar som används för stereologisk kvantifiering av infarktvävnaden.
| Resultat | Contralesional | Ipsilesional | Infarkt |
| Area (μm²) | 151460000 | 155060000 | 22600000 |
| Volym (μm³) | 90876000000 | 93036000000 | 13560000000 |
| Volym Korrigerat för Över Projection (μm³) | 89957100000 | 92046300000 | <strong> 13416600000 |
| Koefficient Fel (Gundersen), m = 0 | 0,068 | 0,077 | 0,067 |
| Koefficient Fel (Gundersen), m = 1 | 0,015 | 0,017 | 0,015 |
| Koefficient Fel (Gundersen), alfa (q) | 0,068 | 0,077 | 0,067 |
| % Infarkt Hemisphere | 14,90 | ||
| Brain Ödem (Ips vol / Cont Vol) | 1,02 | ||
Tabell 2: Representativa exempel på contralesional, ipsilesional och infarkt volymer från Cavalieri metoden använder Stereo Investigator Software.
| Parametrar som används för The Optical fraktionator | |
| Avsnitt Tjocklek (TSF) | 30 | im |
| Syfte | 100X |
| Slice provtagning fraktion (SSF) | 10/01 |
| Counting Frame Höjd | 40 | im |
| Räkna Frame Bredd | 40 | im |
| X rutnät storlek | 230 | im |
| X rutnät storlek | 230 | im |
| Säker Guard | 2 ^ m |
| Optisk Disector Höjd | 14 | im |
Tabell 3: Parametrar som används för stereologisk kvantifiering av infiltrerade neutrofiler efter hjärnischemi med den optiska fraktioneringssonden med hjälp av Stereo Investigator Software.
| Uppskattning av neutrofiler från Optical Fraktionator | |
| Antalet provtagningsplatser | 430 |
| Shape Factor | 6,24 |
| Totala markörer Räknat | 166 |
| Uppskattade neutrofiler genom optisk Fraktionator | 117,608.03 |
| Koefficient Fel (Gundersen), m = 0 | 0,22 |
| Koefficient Fel (Gundersen), m = 1 | 0,09 |
Tabell 4: Ett representativt exempel på de uppskattade infiltrerade neutrofiler efter hjärnischemi med den optiska Fraktionator sonden med hjälp av Stereo Investigator Software.
| CD11b + | Neutrofiler | Monocyter | Mikroglia | |
| Naiv | 25863 ± 4,575.8 | 473 ± 75,8 | 525 ± 191,4 | 19012 ± 1523 |
| Sham 24 tim | 24563 ± 5263 | 873 ± 192,5 | 1124 ± 391,5 | 23734 ± 2910 |
| pMCAO 24 tim | 47922 ± 23174 | 4874 ± 748,7 | 4826 ± 1345 | 35395 ± 10833 |
Tabell 5: representativa resultaten av de uppskattade myeloidceller efter hjärnischemi med Flödescytometri synsätt.
Discussion
Den cerebral ischemi modellen introducerades här ger mycket reproducerbara infarkt volymer bestäms 24-48 timmar och 7 dagar efter MCA ligation av olika metoder 8,15,17. Denna kortex modellen har en låg dödlighet (mindre än 1%) jämfört med andra, minimera antalet djur som används i studier. Ett kritiskt steg för att få denna låga dödligheten är att upprätthålla korrekta aseptiska förhållanden för att undvika infektioner som kan försämra överlevnaden efter stroke induktion. Denna kortex modellen kan inte bara användas som en permanent kortex modell, vilket anses vara en kliniskt relevant modell för translationell forskning 18, men också som en övergångsmodell genom transient ligering av CCA och MCA med en slipknot och bakre reperfusion vid önskad tidpunkt 19. Denna metod har använts framgångsrikt i möss och råttor 17,20. Allt detta pekar på att kortex genom ligering är en hög mångsidig modell av cerebral ischemi med flera program. En critical steg med denna teknik är att den kräver invasiv kirurgi under ett stereomikroskop; kraniotomi bör utföras mycket noggrant så att inte skada okbenet samt MCA. Men användningen av simulerade djur (är som utsätts för det kirurgiska ingreppet, men CCA och MCA ligation inte utförts) ger ett användbart verktyg för att diskriminera kirurgiska ingrepp beroende effekter. Omfattningen av hjärnskada efter denna teknik kan kvantifieras genom flera metoder. Vår protokoll av hjärnsektione, Nissl färgning och efterföljande uppskattning av volymen av Cavalieri möjliggör en exakt kvantifiering av den skadade regionen och minimerar antalet möss som används i denna typ av studier eftersom seriehjärnsektioner kan också användas för olika immunhistokemisk analys. För en bättre prestanda för denna metod, är det viktigt att välja lämpliga parametrar som används i stereology programvara (tabell 1) som kommer att vara nödvändiga för att uppskatta the volymen för de olika regionerna av formeln: V = 1 / ssf * en f * t * ap I (SSF är den skiva samplingsfraktionen, T är den genomsnittliga tjockleken av sektionerna, är en fi området för rutnätet och ap antalet punkter slår strukturen).
Den distala kortex genom ligering kan vara användbart för att karakterisera infiltrerade leukocyter och immun cellsubpopulationer 8,13 som deltar i den inflammatoriska processen efter hjärnskada 1-4. Här föreslår vi två olika metoder för hjärnan immunceller karakterisering, en exakt stereologisk strategi och en flödescytometrisk analys för att bättre karakterisera flera leukocyter subpopulationer.
Med utnyttjande av seriehjärnsektione, kan kvantifiering av det totala antalet neutrofiler uppnås genom den optiska fraktionatorn metoden 16, som uppskattar det totala antalet celler från antalet celler samplade withektar Systematiskt slumpmässigt utvalda (SRS) uppsättning objektiva virtuella räknings utrymmen som täcker hela regionen av intresse, i vårt fall infarktområdet, med jämnt avstånd mellan objektiva virtuella räknings utrymmen i riktningen X, Y och Z. Denna metod ger en korrekt verktyg för att uppskatta totala neutrofila nummer i den ischemiska hjärnan vid olika tidpunkter efter ligering. Även om det inte har visats i denna studie, kan detta protokoll också användas för uppskattning av de olika neutrofila subpopulationer efter ischemi 21 och för en exakt kvantifiering av varje annan cellpopulation som finns i den ischemiska hjärnan liksom andra infiltrerade leukocyter (monocyter / makrofager) och även för att skatta överlevande nervceller eller ens för neurogenes kvantifiering efter stroke. Det viktigaste steget för en korrekt uppskattning i önskat område är valet av lämpliga parametrar, som de som visas i tabell 3 för neutrofil kvantifiering i ischemiska området.Dessa parametrar kommer att användas för den stereology programvara för att beräkna det totala positiva cellen antalet (N) genom att använda ekvationen N = ΣQ- x 1 / ssf x 1 / asf x 1 / TSF (ΣQ- är det totala antalet räknade celler med fraktionatorn är SSF avsnittet samplingsfraktionen, asf är samplingsfraktionen området, och TSF är samplingsfraktionen tjocklek) 5. Även om denna metod är långsammare än andra kvantifiering tekniker (till exempel analys av neutrofila markörer genom mg vävnad, densitometri representativa bilder eller antal neutrofiler per fält), har den fördelen att vara en opartisk och en solid teknik som ger en exakt kvantifiering av cellantal.
Hjärnan leukocyt isolerings tillvägagångssätt möjliggör en samtidig identifiering och kvantifiering av flera immuncell subtyper utan att behöva belasta systemet genom in vivo färgning eller genetiska manipulationer. Efterföljande cellsortering från karakteriseras myeloisk populations eller deras immunomagnetisk separation kan användas för tillämpningar flera nedströms, såsom ytterligare studier på gen- eller proteinuttryck. Den exakta karakterisering av neutrofiler, monocyter och mikroglia erhålls med denna metod ger hög specificitet med avseende på befintliga metoder såsom immunhistokemiska studier, en fördel som gör att tilldela specifika funktioner till de olika myeloida celler som förmedlar hjärnans medfödda immunsvar. Dessutom kan den förlängas ytterligare för att karakterisera andra hjärn populationer med lämplig etikett, liksom blodburna makrofager (CD11b + CD45 hej CD68 +), och den kan tillämpas för att studera andra CNS patologier eller skador. Därför denna teknik ger ett viktigt verktyg för att utforska heterogenitet det inflammatoriska svaret i hjärnan. En huvud begränsning av denna teknik befinner sig på förberedelserna av leukocyt suspension från färsk hjärnvävnad, vilket kan förändraaktiveringstillstånd av cellerna eller deras antigen förändring. Även om denna teknik möjliggör en mer detaljerad kvalitativ karakterisering jämfört med immunhistokemiska studier, ger det en mindre exakt kvantifiering baserad på cellisolering. Trots detta, liknar andra publicerade metoder 9 effektiviteten i vår cellisolering protokoll och den kan effektivt användas för att upptäcka skillnader i antalet hjärnimmunceller mellan kontroll och kortex grupper eller ens mellan kortex grupper som utsätts för olika behandlingar åtta.
Kritiska steg i detta protokoll är vävnaden dissektion, störningar vävnadsförfarandet, och myelin borttagning. När det gäller vävnadssamling, kan en normalisering steg ingå (genom vägning vävnaden samlas in) för att undvika variationer på grund av olika dissektion föreställningar. Dessutom kan normalisering mellan olika kortex grupperna också ske genom infarktvolym (tidigare bestäms av Magnetic Resonance). Ett annat sätt att lösa detta problem är att använda hela ipsilaterala halvklotet av både ischemiska och kontrollgrupper, eller ens använda den kontrahjärn ischemisk musen som en kontroll för att minimera antalet djur som används. Även om detta tillvägagångssätt undviker skillnader mellan varje dissektion, den har en största nackdelen; en utspädningsfaktor sättes genom att öka det totala antalet celler, men inte antalet myeloidceller som uteslutande är belägna i kärn och peri-infarkt områden av den ipsilaterala cortex. Beträffande störningar vävnad, illustrerar detta protokoll stegen för den mekaniska störning av hjärnceller, undvika enzymatiska behandlingar och förebyggande ytantigen förändring 9,22, en viktig fråga för ytterligare kvalitativ och kvantitativ analys av de inflammatoriska cellsubpopulationer. Utöver förberedelserna av cellsuspensionen av intresse, är myelin avlägsnande från hjärnprover ett starkt rekommenderat steg för att undvika störningar med downstream applikationer, såsom immunomagnetisk cellseparation eller flödescytometri 23,24. Detta kan åstadkommas med hjälp av olika metoder, såsom sackaros eller Percoll gradienter, eller anti-myelin pärlor. Här, och baserat på tidigare studier som jämför olika metoder för hjärncell fjädring isolering, mekanisk störning i kombination med Percoll användning för att avlägsna myelin används för att förbättra cellutbyten och livskraft 25.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Photonic Led F1 | WPI | 571329-8 | Equipment |
| Temp Controller | Panlab | HB 101/2 | Equipment |
| Volvere GX | NSK | Ne22L | Equipment |
| Microscope | WPI | PZMIII-BS | Equipment |
| Stainless Steel Burrs | FST | 19007-14 | Surgical material |
| Forceps Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | Surgical material |
| Forceps Dumont #5SF | FST | 11252-30 | Surgical material |
| Suture 6/0 | LorcaMarin | 55108 | Surgical material |
| Suture 9/0 | LorcaMarin | 61966 | Surgical material |
| Nikon Eclipse | Nikon | TE300 | Equipment |
| Isoflurane | Esteve | 571329-8 | Chemical |
| Sodium Pentobarbital | Vetoquinol | 570681 | Chemical |
| Freezing microtome | Leica Microsystems GmbH | SM2000R | Equipment |
| Superfrost slides | Thermo Scientific | 2014-07 | Lab material |
| Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | Chemical |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TE300 | Equipment |
| XYZ motorized computer stage and controller | Ludl electronics Products | Equipment | |
| Stereo Investigator System | Microbrightfield | Version 7.003 software | Software |
| 5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle | Thomas Scientific | 0913X70 | Lab Material |
| Polypropylene 50 ml Oak Ridge Centrifuge Tube | Nalgene | 3119-0050 | Lab material |
| Percoll | Sigma | p1644-100 | Chemical |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-702F | Chemical |
| Beckman Ultracentrifugue | Beckman Coulter | Equipment | |
| Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti | Beckman Coulter | Equipment | |
| BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron | BD | BD 352340 | Lab Material |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3733-500G | Reagment |
| FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi | 130-092-575 | Antibody |
| CD11b-FITC, human and mouse | Miltenyi | 130-098-085 | Antibody |
| CD45-PE, mouse | Miltenyi | 130-102-596 | Antibody |
| Anti-Ly-6G-APC, mouse | Miltenyi | 130-102-936 | Antibody |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C | Biolegend | 128012 | Antibody |
| BD FACS Flow | BD | 342003 | Reagment |
| BD FACSCalibur; 4-color | BD | 342975 | Equipment |
| BD Cell Quest Pro Software | BD | Software | |
| FlowJo software | Treestar inc. | Software |
References
- Chamorro, A., et al.
- Iadecola, C., Anrather, J. The immunology of stroke: from mechanisms to translation. Nat Med. 17, 796-808 (2011).
- Ramlackhansingh, A. F., et al. Inflammation after trauma: microglial activation and traumatic brain injury. Annals of Neurology. 70, 374-383 (2011).
- Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231, 482-497 (1991).
- Charleston, J. S. Estimating cell number in the central nervous system by stereological methods: the optical disector and fractionator. Current Protocols in Toxicology. 12 (Unit 12.6), (2001).
- Begega, A., et al. Unbiased estimation of the total number of nervous cells and volume of medial mammillary nucleus in humans. Experimental Gerontology. 34, 771-782 (1999).
- Cuartero, M. I., et al. N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPARgamma Agonist Rosiglitazone. Stroke; a. Journal of Cerebral Circulation. 44 (12), 3498-3508 (2013).
- Campanella, M., Sciorati, C., Tarozzo, G., Beltramo, M. Flow cytometric analysis of inflammatory cells in ischemic rat brain. Stroke. 33, 586-592 (2002).
- Carson, M. J., Reilly, C. R., Sutcliffe, J. G., Lo, D. Mature microglia resemble immature antigen-presenting cells. Glia. 22, 72-85 (1998).
- Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. J Neuroinflammation. 8, 174 (2011).
- Denker, S. P., et al. Macrophages are comprised of resident brain microglia not infiltrating peripheral monocytes acutely after neonatal stroke. Journal of Neurochemistry. 100, 893-904 (2007).
- Ballesteros, I., et al. Rosiglitazone-induced CD36 up-regulation resolves inflammation by PPARgamma and 5-LO-dependent pathways. Journal of Leukocyte Biology. 95 (4), 587-598 (2013).
- Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area. J Microsc. 150, 117-136 (1988).
- Hernández-Jiménez, M., et al. Silent Information Regulator 1 Protects the Brain Against Cerebral Ischemic Damage. Stroke. 44 (8), 2333-2337 (2013).
- Gundersen, H. J., et al. The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96, 857-881 (1988).
- Godino, M. E. C., et al. Amelioration of ischemic brain damage by peritoneal dialysis. J Clin Invest. 123, 4359-4363 (2013).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1310-1316 (2012).
- García-Yébenes, I., et al. Iron overload, measured as serum ferritin, increases brain damage induced by focal ischemia and early reperfusion. Neurochem Int. 61, 1364-1369 (2012).
- Sobrado, M., et al. Synthesis of lipoxin A4 by 5-lipoxygenase mediates PPARgamma-dependent, neuroprotective effects of rosiglitazone in experimental stroke. J Neurosci. 29, 3875-3884 (2009).
- Cuartero, M. I., et al. N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPARγ Agonist Rosiglitazone. Stroke. 44, 3498-3508 (2013).
- Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression. Journal of Immunological Methods. 194, 71-75 (1996).
- Pfenninger, C. V., et al. CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells. Cancer Research. 67, 5727-5736 (2007).
- Tham, C. S., Lin, F. F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression. International Journal of Developmental Neuroscience : the Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 21, 431-443 (2003).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
