転写分析のための大規模ゼブラフィッシュ胚心臓解剖
Summary
ゼブラフィッシュの心臓発生中の心臓遺伝子発現プロファイルを分析するために、総RNAを単離した心臓から抽出されなければならない。ここでは、心臓特異的mRNAを得るために、ゼブラフィッシュの胚からの迅速な手動の切開によって、機能/鼓動心を収集するためのプロトコルを提示する。
Abstract
ゼブラフィッシュ胚の心臓は胚全体のごく一部を表す、わずか数百の細胞から構成されている。したがって、グローバル胚トランスクリプトによってマスクされているから心臓のトランスクリプトームを防止するためには、さらなる分析のために心臓の十分な数を収集する必要がある。ゼブラフィッシュの心臓の開発が急速に進行していくまた、心臓の収集およびRNA抽出方法は、サンプルの均一性を確保するために迅速である必要がある。ここでは、ゼブラフィッシュの胚から機能/鼓動心を収集するための迅速な手動の解剖プロトコルを提示する。これは、トランスクリプトーム解析によって、このような定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCRの）として、心臓特異的な遺伝子発現レベルを決定するために、後続の心臓特異的RNA抽出のための必須の前提条件である。この方法は、他の組織と比較して、ゼブラフィッシュ胚の心臓の差動接着特性に基づいている。これは、迅速なPHYが可能になり流体せん断力の中断、段階的にろ過およびトランスジェニック、蛍光標識された心のマニュアルコレクションの組み合わせによる心外組織から心臓のsical分離。
Introduction
ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ） が広くによりサイズが小さく、蛍光タンパク質の組織特異的な発現を有するトランスジェニックレポーターラインの利用可能性と合わせて、高速で透明かつ子宮外胚発生、 インビボでの器官形成を研究するために発生生物学で使用されている。初期のゼブラフィッシュ胚の酸素は、心拍、血流に依存しないので、この小さな脊椎動物は、心臓発生を研究するために特に適している。これらの機能は、心血管の変異体1,2の多数の特徴付けを可能にしたとゼブラフィッシュは現在、心疾患3を研究するための広く認識モデル生物である。
胚発生の間の遺伝子発現を研究するために、転写物は一般にホールマウントin situハイブリダイゼーション （WISH）4によって分析され、RT-qPCRを5、マイクロアレイ6、または次世代シークエンシング（RNA配列）7。同時にWISHは全体胚内の遺伝子発現の空間的·時間的な分析を可能にする、転写レベルは通常、RT-qPCRを、マイクロアレイまたはRNA-配列アプローチによって評価される。しかしながら、これらの方法は、特異的な遺伝子発現プロファイリングのための組織の濃縮を必要とする。
ゼブラフィッシュ胚の心臓は全体の胚のごく一部を表すので、心臓の開発中にトランスクリプトーム研究は心の解剖と濃縮のためのプロトコルが必要。また、生理学的に関連するデータを得るためには、RNA抽出まで、完全に機能的心臓組織を維持することが重要である。ここでは、急速に生理的に通常の単離及び効率的にさらなる分析のための高品質なRNAサンプルを得るために、ゼブラフィッシュの胚の数百人から心を打つためのプロトコルを記述します。本発明の方法は、バーンズとマクレー、2006年8によって報告されたプロトコルに基づいています。心臓組織の充実のために、両方の方法は、トランスジェニック心筋のレポーターラインを使用する他の組織に対するゼブラフィッシュ胚の心臓の差動接着特性を利用する。簡単に言えば、狭いピペットチップを通して上下に多くの胚をピペッティングすることにより、心臓を同時に胚の体から解放され、その後、2急速ろ過段階で胚の破片から分離。蛍光標識した心は、手動で残りの破片から選別し、さらなる処理のために収集されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、遺伝子発現解析のためのゼブラフィッシュ胚の心臓組織の迅速な濃縮を可能にする。 RNA精製だけで十分で動作しますので、心の喪失は、プロトコルのすべての段階で阻止される場合は、最初の、試料の量が大幅に改善されている：心臓特異的RNAサンプルの量と質が大幅にいくつかの重要なステップに依存します出発材料。次に、実験者に完全に依存したサンプルの純度は…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank C. Burns, C. McRae for outlining the basic principle of this purification protocol, and F. Priller for initial implementation of this method in our lab. S.A.-S. is supported by a Heisenberg professorship of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). This work was supported by DFG grant SE2016/7-1.
Materials
| Equipment for raising fish and collecting eggs | see the Zebrafish Book11 for details | ||
| Fluorescence stereomicroscope | |||
| Refrigerated Microcentrifuge | |||
| UV-Spectrophotometer | eg. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| Nucleic acid electrophoresis chamber | |||
| Petri dishes 4cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium | |||
| Micropipettes and tips (P20, P100, P1000) | |||
| 1,5ml centrifugation tubes | |||
| 15ml and 50ml centrifugation tubes | |||
| Pair of Dumont #5 forceps | |||
| ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Phase lock gel, heavy, 1,5ml tubes | Prime | 2302810 | |
| Egg water medium | 60μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue | ||
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | ||
| Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4mg/ml Tricaine stock solution, pH 7 |
| 1% agarose (in E3 medium) | |||
| 1% agarose gel (in TBE buffer) | |||
| Leibovitz´s L-15 medium | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | 20 µg/µL in RNase-free water |
| chloroform | |||
| isopropanol | |||
| 75% ethanol (in DEPC-ddH2O) | |||
| Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O | |||
| Nucleic acid loading buffer | |||
| TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis |
Riferimenti
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