पेप्टाइड arrays का उपयोग प्रोटीन-प्रोटीन सहभागिता वाली साइटों की पहचान
Summary
Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.
Abstract
प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत जीव की जीवित कोशिका और नियंत्रण homeostasis में प्रक्रियाओं का सबसे मध्यस्थता. बिगड़ा प्रोटीन बातचीत प्रोटीन बातचीत महत्वपूर्ण दवा लक्ष्य बना रही है, बीमारी हो सकती है. यह आणविक स्तर पर इन संबंधों को समझने के लिए इस प्रकार अत्यधिक महत्वपूर्ण है. प्रोटीन बातचीत सेलुलर और जैव रासायनिक assays से मात्रात्मक biophysical assays के लिए लेकर विभिन्न तकनीकों का उपयोग कर अध्ययन कर रहे हैं, और इन प्रोटीन डोमेन के साथ या पेप्टाइड्स के साथ, पूर्ण लंबाई प्रोटीन के साथ या तो किया जा सकता है. पेप्टाइड्स पेप्टाइड्स आसानी से संश्लेषित किया जा सकता है, क्योंकि प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने और विशिष्ट बातचीत साइटों पर ध्यान केंद्रित अनुमति देने के लिए के रूप में उत्कृष्ट उपकरण सेवा करते हैं. पेप्टाइड सरणियों चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए लक्ष्य प्रोटीन कि बाँध पेप्टाइड्स के लिए दो प्रोटीन के बीच बातचीत साइटों की पहचान करने के साथ ही स्क्रीनिंग कर सकें. उन्होंने यह भी उच्च throughput एसएआर पढ़ाई अनुमति देते हैं. बाध्यकारी साइटों, एक typi की पहचान के लिएकाल पेप्टाइड सरणी आमतौर पर आंशिक रूप से वांछित लक्ष्य प्रोटीन के एक या एक से अधिक पार्टनर प्रोटीन से भरा दृश्यों से व्युत्पन्न 10-20 अवशेषों पेप्टाइड्स ओवरलैपिंग होता. लक्ष्य प्रोटीन बाध्यकारी के लिए सरणी स्क्रीनिंग प्रोटीन की ही छोटी राशि का उपयोग कर एक आसान और तेजी से विधि में साथी प्रोटीन में बाध्यकारी साइटों, के लिए इसी बाध्यकारी पेप्टाइड का पता चलता है.
इस लेख में हम एक लक्ष्य प्रोटीन और उसके सहयोगियों के बीच बातचीत साइटों मानचित्रण के लिए पेप्टाइड सरणियों स्क्रीनिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. पेप्टाइड सरणी खाते में उनके माध्यमिक संरचनाओं लेने के साथी प्रोटीन के दृश्यों पर आधारित बनाया गया है. इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया सरणियों INTAVIS Bioanalytical साधनों द्वारा तैयार Celluspots सरणियों थे. सरणी बंधन unspecific और फिर अध्ययन प्रोटीन के साथ incubated को रोकने के लिए बंद है. एक एंटीबॉडी का उपयोग कर जांच प्रोटीन के बीच विशिष्ट बातचीत साइटों के लिए इसी बाध्यकारी पेप्टाइड का पता चलता है.
Introduction
प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत जीवित कोशिका में प्रक्रियाओं का सबसे मध्यस्थता. बिगड़ा प्रोटीन बातचीत प्रोटीन बातचीत महत्वपूर्ण दवा लक्ष्य बना रही है, बीमारी हो सकती है. यह आणविक स्तर पर इन संबंधों को समझने के लिए इस प्रकार अत्यधिक महत्वपूर्ण है. प्रोटीन बातचीत सेलुलर और जैव रासायनिक assays से मात्रात्मक biophysical assays के लिए लेकर विभिन्न तकनीकों का उपयोग कर अध्ययन कर रहे हैं, और इन प्रोटीन डोमेन के साथ या पेप्टाइड्स के साथ, पूर्ण लंबाई प्रोटीन के साथ या तो किया जा सकता है. पेप्टाइड्स प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के रूप में उत्कृष्ट उपकरण सेवा करते हैं. पेप्टाइड्स आसानी से संश्लेषित और एक तरफ और दूसरी ओर 1,2 पर एक उच्च throughput ढंग से कई प्रोटीन ठिकानों पर एक विशिष्ट बातचीत साइट पर ध्यान केंद्रित की अनुमति किया जा सकता है क्योंकि यह है. पेप्टाइड सरणी स्क्रीनिंग है एक तेजी से, एक कम समय 3 में कई सहयोगियों के साथ एक लक्ष्य प्रोटीन की बातचीत के बारे में डेटा की एक बड़ी राशि प्राप्त करने के लिए विधि को करने के लिए आसान. प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने और विश्लेषण करने के लिए अन्य जैव रासायनिक या biophysical विधियों के विपरीत, पेप्टाइड सरणी स्क्रीनिंग प्रोटीन की एक बहुत कम एकाग्रता की आवश्यकता है और बंधन बहुत कमजोर पता लगा सकते हैं. पेप्टाइड सरणियों एंजाइम गतिविधियों 6 और उच्च throughput का अध्ययन, ऐसे प्रोटीन-प्रोटीन या रिसेप्टर ligand बातचीत साइटों 4, homo- या असमलैंगिक oligomerization इंटरफेस का मानचित्रण के रूप में पेप्टाइड प्रोटीन बातचीत में कई अनुप्रयोगों के लिए निस्र्पक एंटीबॉडी 5 epitopes इस्तेमाल किया जा सकता संरचना गतिविधि संबंध (एसएआर) 7 अध्ययन करता है. पेप्टाइड सरणी स्क्रीनिंग के बारे में गहराई से समीक्षा के लिए Katz एट अल देखें. 4
पेप्टाइड सरणियों के कई प्रकार वर्तमान में मौजूद हैं. पेप्टाइड्स के संश्लेषण के लिए मुख्य रूप से स्पॉट तकनीक 4,8 का उपयोग, सीधे ठोस समर्थन पर पेप्टाइड्स के ठोस समर्थन, या संश्लेषण के लिए उन्हें संलग्न करने से पहले: पेप्टाइड सरणियों बनाने के लिए दो प्रमुख सिंथेटिक रणनीतियों रहे हैं.पेप्टाइड्स 9 fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) रसायन शास्त्र 8 से आमतौर पर ठोस समर्थन पर संश्लेषित कर रहे हैं. आम सिंथेटिक योजनाओं के अलावा सी टर्मिनस के माध्यम से पेप्टाइड एन टर्मिनस के माध्यम से लगाव (जैसे, जेपीटी pepstar सरणियों 9) और पेप्टाइड लगाव हैं (उदाहरण के लिए, PEPSCAN pepchip सरणियों 10, जेपीटी pepspot सरणियों 9 और INTAVIS celluspot सरणियों 11) 4. ठोस समर्थन भिन्न है और इसलिए इसे करने के लिए पेप्टाइड युग्मन के रसायन शास्त्र करता है सकते हैं. CYS समाप्त पेप्टाइड्स thiol समूह 12 के माध्यम से गिलास स्लाइड से जुड़ा जा सकता है. एक पेप्टाइड के एन टर्मिनस covalently अमीनो एसिड की एस्टरीफिकेशन के माध्यम से सेलूलोज़ झिल्ली पर एक हाइड्रॉक्सिल समूह के लिए बाध्य किया जा सकता है 8 जुड़ी.
यहाँ हम प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के अध्ययन के लिए एक विधि के रूप में पेप्टाइड सरणियों स्क्रीनिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. हम इस्तेमाल सरणी बड़े एमो युक्त एक माइक्रो सरणी है जो Celluspots सरणी, हैएक गिलास स्लाइड द्वारा समर्थित एक छोटे सेलूलोज़ झिल्ली पर धब्बे (अप करने के लिए 384 स्थानों में से डुप्लिकेट) की UNT. यह कम प्रोटीन की मात्रा और एंटीबॉडी के साथ काम कर और ही प्रयोग प्रति डेटा की महत्वपूर्ण राशि प्राप्त करने के लिए सक्षम बनाता है. इस सरणी भी बाध्यकारी कम आत्मीयता का पता लगाने की अनुमति देता है कि उच्च पेप्टाइड घनत्व होता है. सरणी सामान्य सेल प्रसार 13 को नियंत्रित करने के लिए अत्यधिक महत्वपूर्ण है जो STIL-CHFR बातचीत, मानचित्रण के लिए इस्तेमाल किया गया था. दो प्रोटीन के बीच अनियंत्रित बातचीत कैंसर के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इस बातचीत मानचित्रण द्वारा हम विशिष्ट बाध्यकारी साइट और अवशेषों 14 बाध्यकारी पाया. यह इस प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत को बाधित कि तर्कसंगत अवरोधकों को डिजाइन करने के लिए मार्ग प्रशस्त.
Protocol
Representative Results
Discussion
पेप्टाइड सरणी स्क्रीनिंग उसके सहयोगियों में एक लक्ष्य प्रोटीन की बाध्यकारी साइटों की पहचान करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है. इस परख प्रदर्शन करने के लिए तेजी से और आसान है और परिणाम एक या दो कार्य दिवस…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
वायुसेना यूरोपीय समुदाय के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद से एक प्रारंभिक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (FP7 / 2007-2013) / ईआरसी अनुदान समझौता एन 203413 ° और जटिल systems.HA जैव संकर और एअर इंडिया के लिए मिनर्वा केंद्र से समर्थन कर रहे हैं जेरूसलम के हिब्रू विश्वविद्यालय में उन्नत डिग्री छात्रों के लिए डालिया और दान Maydan फैलोशिप द्वारा.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| His-probe Antibody (H-3) HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-8036 HRP | |
| EZ-ECL Kit | Biological industries | 20-500-120 | |
| Skim Milk | Becton, Dickinson and Company | 232100 | |
| LAS-3000 camera | FUJI film |
Riferimenti
- Benyamini, H., Friedler, A. Using peptides to study protein–protein interactions. Future Medicinal Chemistry. 2 (6), 989-1003 (2010).
- Geysen, H. M., Wagner, C. D. Isotope or mass encoding of combinatorial libraries. Chemistry & Biology. 3 (8), 679-688 (1996).
- Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).
- Katz, C., Levy-Beladev, L., Rotem-Bamberger, S., Rito, T., Rudiger, S. G., Friedler, A. Studying protein-protein interactions using peptide arrays. Chem Soc Rev. 40 (5), 2131-2145 (2011).
- Hansen, L. B., Buus, S., Schafer-Nielsen, C. Identification and Mapping of Linear Antibody Epitopes in Human Serum Albumin Using High-Density Peptide Arrays. PLoS ONE. 8 (7), (2013).
- Uecker, A. A substrate peptide for the FLT3 receptor tyrosine kinase. British Journal of Haematology. 144 (1), 127-130 (2009).
- Gabizon, R., Faust, O., Benyamini, H., Nir, S., Loyter, A., Friedler, A. Structure-activity relationship studies using peptide arrays: the example of HIV-1 Rev-integrase interaction. Med. Chem. Commun. 4 (1), 252-259 (2013).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique: Synthetic peptide arrays on membrane supports—principles and applications. Journal of Immunological Methods. 267 (1), 13-26 (2002).
- Falsey, J. R., Renil, M., Park, S., Li, S., Lam, K. S. Peptide and Small Molecule Microarray for High Throughput Cell Adhesion and Functional Assays. Bioconjugate Chemistry. 12 (3), 346-353 (2001).
- Castiel, A., Danieli, M. M. The Stil protein regulates centrosome integrity and mitosis through suppression of Chfr. Journal of Cell Science. 124 (4), 532-539 (2011).
- Amartely, H., David, A., Lebendiker, M., Benyamini, H., Izraeli, S., Friedler, A. The STIL protein contains intrinsically disordered regions that mediate its protein-protein interactions. Chemical Communications. 50, 5245-5247 (2013).
- Izraeli, S., Lowe, L. A. The SIL gene is required for mouse embryonic axial development and left-right specification. Nature. 399 (6737), 691-694 (1999).
- Izraeli, S., Colaizzo-Anas, T., Bertness, V. L., Mani, K., Aplan, P. D., Kirsch, I. R. Expression of the SIL gene is correlated with growth induction and cellular proliferation. Cell Growth Differ. 8 (11), 1171-1179 (1997).
- Arquint, C., Sonnen, K. F., Stierhof, Y. -. D., Nigg, E. a Cell-cycle-regulated expression of STIL controls centriole number in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1342-1352 (2012).
- Tang, C. J., Lin, S. Y. The human microcephaly protein STIL interacts with CPAP and is required for procentriole formation. Embo J. 30 (23), 4790-4804 (2011).
- Vulprecht, J., David, A. STIL is required for centriole duplication in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1353-1362 (2012).
- Campaner, S., Kaldis, P., Izraeli, S., Kirsch, I. R. Sil phosphorylation in a Pin1 binding domain affects the duration of the spindle checkpoint. Mol Cell Biol. 25 (15), 6660-6672 (2005).
- Kasai, K., Inaguma, S., Yoneyama, A., Yoshikawa, K., Ikeda, H. SCL/TAL1 interrupting locus derepresses GLI1 from the negative control of suppressor-of-fused in pancreatic cancer cell. Cancer Res. 68 (19), 7723-7729 (2008).
- Chaturvedi, P., Sudakin, V. Chfr regulates a mitotic stress pathway through its RING-finger domain with ubiquitin ligase activity. Cancer Res. 62 (6), 1797-1801 (2002).
- Olaussen, K. a., Commo, F. Synergistic proapoptotic effects of the two tyrosine kinase inhibitors pazopanib and lapatinib on multiple carcinoma cell lines. Oncogene. 28 (48), 4249-4260 (2009).
- Reingewertz, T. H., Britan-Rosich, E. Mapping the Vif–A3G interaction using peptide arrays: A basis for anti-HIV lead peptides. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (12), 3523-3532 (2013).
- Katz, C., Benyamini, H. Molecular basis of the interaction between the antiapoptotic Bcl-2 family proteins and the proapoptotic protein ASPP2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12277-12282 (2008).
- Katz, C., Zaltsman-Amir, Y., Mostizky, Y., Kollet, N., Gross, A., Friedler, A. Molecular Basis of the Interaction between Proapoptotic Truncated BID (tBID) Protein and Mitochondrial Carrier Homologue 2 (MTCH2) Protein: KEY PLAYERS IN MITOCHONDRIAL DEATH PATHWAY. Journal of Biological Chemistry. 287 (18), 15016-15023 (2012).
- Rosenberg, M. M., Ronen, D., Lahav, N., Nazirov, E., Ravid, S., Friedler, A. High resolution characterization of myosin IIC tailpiece and its effect on filament assembly. Journal of Biological Chemistry. 288 (14), 9779-9789 (2013).
