تحديد مواقع التفاعل البروتين البروتين عن طريق الببتيد صفائف
Summary
Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.
Abstract
البروتين البروتين التفاعلات توسط معظم العمليات في الخلية والسيطرة التوازن الحية للكائن الحي. تفاعلات البروتين ضعف قد يؤدي إلى المرض، مما يجعل تفاعلات البروتين أهداف هامة المخدرات. وبالتالي فمن المهم جدا لفهم هذه التفاعلات على المستوى الجزيئي. يتم دراسة التفاعلات البروتينية باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات التي تتراوح بين المقايسات الخلوية والكيموحيوية لفحوصات الفيزيائية الحيوية الكمية، وهذه يمكن أن يؤديها إما مع البروتينات كامل طول، مع مجالات البروتين أو مع الببتيدات. الببتيدات تخدم أدوات ممتازة لدراسة تفاعلات البروتين منذ الببتيدات يمكن تصنيعه بسهولة والسماح للتركيز على مواقع التفاعل محددة. صفائف الببتيد تمكن من تحديد مواقع التفاعل بين اثنين من البروتينات وكذلك الكشف عن الببتيدات التي تربط البروتين المستهدف لأغراض علاجية. أنها تسمح أيضا إنتاجية عالية دراسات ريال. لتحديد مواقع الربط، وtypiكال الببتيد عادة يحتوي على مجموعة متداخلة جزئيا 10-20 بقايا الببتيدات المستمدة من سلاسل كاملة من واحد أو أكثر من البروتينات شريك من البروتين الهدف المنشود. فحص مجموعة للربط البروتين المستهدف يكشف عن الببتيدات ملزمة، المقابلة لمواقع الربط في البروتينات شريك، في وسيلة سهلة وسريعة فقط باستخدام كمية صغيرة من البروتين.
في هذه المقالة وصفنا بروتوكولا لفحص صفائف الببتيد لرسم خرائط مواقع التفاعل بين البروتين المستهدفة وشركائها. تم تصميم مجموعة الببتيد على أساس تسلسل البروتينات شريك مع مراعاة الهياكل الثانوية الخاصة بهم. كانت المصفوفات المستخدمة في هذا البروتوكول صفائف Celluspots بواسطة INTAVIS الآلات Bioanalytical إعدادها. تم حظر مجموعة لمنع غير محددة ملزمة ثم حضنت مع البروتين دراستها. الكشف باستخدام الأجسام المضادة يكشف الببتيدات ملزم المقابلة لمواقع محددة تفاعل بين البروتينات.
Introduction
البروتين البروتين التفاعلات توسط معظم العمليات في الخلية الحية. تفاعلات البروتين ضعف قد يؤدي إلى المرض، مما يجعل تفاعلات البروتين أهداف هامة المخدرات. وبالتالي فمن المهم جدا لفهم هذه التفاعلات على المستوى الجزيئي. يتم دراسة التفاعلات البروتينية باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات التي تتراوح بين المقايسات الخلوية والكيموحيوية لفحوصات الفيزيائية الحيوية الكمية، وهذه يمكن أن يؤديها إما مع البروتينات كامل طول، مع مجالات البروتين أو مع الببتيدات. الببتيدات تخدم أدوات ممتازة لدراسة تفاعلات البروتين. هذا لأن الببتيدات يمكن توليفها بسهولة وتسمح بالتركيز على موقع التفاعل معين من جهة، وعلى أهداف متعددة في البروتين بطريقة إنتاجية عالية على الآخر 1،2 اليد. فحص مجموعة الببتيد هو سريعة وسهلة لأداء طريقة للحصول على كمية كبيرة من البيانات حول تفاعلات البروتين المستهدف مع العديد من الشركاء في وقت قصير 3. خلافا لأساليب الكيمياء الحيوية أو الفيزيائية الحيوية الأخرى لكشف وتحليل تفاعلات البروتين البروتين، وفحص مجموعة الببتيد يتطلب تركيز منخفض جدا من البروتين ويمكن الكشف ضعيفة جدا ملزمة. صفائف الببتيد يمكن استخدامها في العديد من التطبيقات في التفاعلات الببتيد البروتين مثل رسم الخرائط من البروتين البروتين أو مواقع التفاعل مستقبلات يجند 4، واجهات هومو أو مغاير oligomerization، والأجسام المضادة التي تميز الحواتم 5، ودراسة الأنشطة الإنزيمية 6 وإنتاجية عالية بالهيكل علاقة النشاط (SAR) دراسات (7). لإجراء استعراض معمق حول فحص مجموعة الببتيد رؤية كاتز وآخرون. 4
عدة أنواع من المصفوفات الببتيد موجودة حاليا. هناك نوعان من الاستراتيجيات الصناعية الكبرى لجعل صفائف الببتيد: تركيب الببتيدات قبل إرفاقها إلى دعم قوي، أو تركيب الببتيدات مباشرة على دعم قوي، وذلك أساسا باستخدام 4،8 تقنية SPOT. الويتم تصنيعه الببتيدات على دعم قوي عادة بنسبة 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) كيمياء 8. بين مخططات الاصطناعية شيوعا هي مرفق الببتيد من خلال محطة N (على سبيل المثال، JPT صفائف pepstar 9) والتعلق الببتيد من خلال محطة C (على سبيل المثال، PEPSCAN صفائف pepchip 10، JPT صفائف pepspot 9 و INTAVIS صفائف celluspot 11) 4. الدعم القوي يمكن أن تختلف وهكذا يفعل كيمياء اقتران الببتيد إليها. يمكن تركيبها الببتيدات CYS لإنهاء الشرائح الزجاجية عبر مجموعة ثيول 12. وN محطة من الببتيد يمكن تساهميا منضما إلى مجموعة الهيدروكسيل على الغشاء السليلوز من خلال الأسترة من الأحماض الأمينية المرفقة 8.
هنا نقدم بروتوكول مفصلة لفرز المصفوفات الببتيد كوسيلة لدراسة تفاعلات البروتين البروتين. مجموعة استخدمنا هي مجموعة Celluspots، وهي مجموعة صغيرة تحتوي على عمو كبيرالاتحاد الوطني للعمال من البقع (التكرارات تصل إلى 384 نقاط) على الغشاء السليلوز صغيرة تدعمها شريحة زجاجية. وهذا يتيح العمل مع كميات منخفضة من البروتين والأجسام المضادة والحصول على كمية كبيرة من البيانات في تجربة واحدة. يحتوي هذا مجموعة أيضا كثافة عالية الببتيد الذي يسمح الكشف عن انخفاض تقارب ملزمة. واستخدمت المصفوفة لرسم خرائط التفاعل STIL-CHFR، وهو أمر مهم للغاية للسيطرة تكاثر الخلايا العادية 13. تفاعل غير المنضبط بين اثنين من البروتينات يمكن أن يؤدي إلى تطور السرطان. عن طريق تعيين هذا التفاعل وجدنا موقع ملزم محدد والمخلفات 14 ملزمة. هذا يمهد الطريق لتصميم مثبطات العقلانية التي تحول دون هذا التفاعل البروتين البروتين.
Protocol
Representative Results
Discussion
الببتيد فحص مجموعة هو أداة ممتازة لتحديد مواقع الربط من البروتين المستهدف في شركائها. هذا الاختبار هو سريعة وسهلة لأداء ويمكن الحصول على النتائج في واحد أو يومين عمل. الببتيد فحص مجموعة هي متعددة ويمكن استخدامها لأغراض كثيرة. أنها يمكن أن تستخدم لوصف تعديلات ما بعد ا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم وأيد AF بمنحة بدءا من مجلس البحوث الأوروبي في إطار البرنامج الإطاري السابع للجماعة الأوروبية (FP7 / 2007-2013) / اتفاق ERC غرانت N ° 203413 ومركز منيرفا لبيو الهجين systems.HA معقدة ومنظمة العفو الدولية بواسطة داليا ودان رشاف الزمالة لطلاب درجة متقدمة في الجامعة العبرية في القدس.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| His-probe Antibody (H-3) HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-8036 HRP | |
| EZ-ECL Kit | Biological industries | 20-500-120 | |
| Skim Milk | Becton, Dickinson and Company | 232100 | |
| LAS-3000 camera | FUJI film |
Riferimenti
- Benyamini, H., Friedler, A. Using peptides to study protein–protein interactions. Future Medicinal Chemistry. 2 (6), 989-1003 (2010).
- Geysen, H. M., Wagner, C. D. Isotope or mass encoding of combinatorial libraries. Chemistry & Biology. 3 (8), 679-688 (1996).
- Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).
- Katz, C., Levy-Beladev, L., Rotem-Bamberger, S., Rito, T., Rudiger, S. G., Friedler, A. Studying protein-protein interactions using peptide arrays. Chem Soc Rev. 40 (5), 2131-2145 (2011).
- Hansen, L. B., Buus, S., Schafer-Nielsen, C. Identification and Mapping of Linear Antibody Epitopes in Human Serum Albumin Using High-Density Peptide Arrays. PLoS ONE. 8 (7), (2013).
- Uecker, A. A substrate peptide for the FLT3 receptor tyrosine kinase. British Journal of Haematology. 144 (1), 127-130 (2009).
- Gabizon, R., Faust, O., Benyamini, H., Nir, S., Loyter, A., Friedler, A. Structure-activity relationship studies using peptide arrays: the example of HIV-1 Rev-integrase interaction. Med. Chem. Commun. 4 (1), 252-259 (2013).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique: Synthetic peptide arrays on membrane supports—principles and applications. Journal of Immunological Methods. 267 (1), 13-26 (2002).
- Falsey, J. R., Renil, M., Park, S., Li, S., Lam, K. S. Peptide and Small Molecule Microarray for High Throughput Cell Adhesion and Functional Assays. Bioconjugate Chemistry. 12 (3), 346-353 (2001).
- Castiel, A., Danieli, M. M. The Stil protein regulates centrosome integrity and mitosis through suppression of Chfr. Journal of Cell Science. 124 (4), 532-539 (2011).
- Amartely, H., David, A., Lebendiker, M., Benyamini, H., Izraeli, S., Friedler, A. The STIL protein contains intrinsically disordered regions that mediate its protein-protein interactions. Chemical Communications. 50, 5245-5247 (2013).
- Izraeli, S., Lowe, L. A. The SIL gene is required for mouse embryonic axial development and left-right specification. Nature. 399 (6737), 691-694 (1999).
- Izraeli, S., Colaizzo-Anas, T., Bertness, V. L., Mani, K., Aplan, P. D., Kirsch, I. R. Expression of the SIL gene is correlated with growth induction and cellular proliferation. Cell Growth Differ. 8 (11), 1171-1179 (1997).
- Arquint, C., Sonnen, K. F., Stierhof, Y. -. D., Nigg, E. a Cell-cycle-regulated expression of STIL controls centriole number in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1342-1352 (2012).
- Tang, C. J., Lin, S. Y. The human microcephaly protein STIL interacts with CPAP and is required for procentriole formation. Embo J. 30 (23), 4790-4804 (2011).
- Vulprecht, J., David, A. STIL is required for centriole duplication in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1353-1362 (2012).
- Campaner, S., Kaldis, P., Izraeli, S., Kirsch, I. R. Sil phosphorylation in a Pin1 binding domain affects the duration of the spindle checkpoint. Mol Cell Biol. 25 (15), 6660-6672 (2005).
- Kasai, K., Inaguma, S., Yoneyama, A., Yoshikawa, K., Ikeda, H. SCL/TAL1 interrupting locus derepresses GLI1 from the negative control of suppressor-of-fused in pancreatic cancer cell. Cancer Res. 68 (19), 7723-7729 (2008).
- Chaturvedi, P., Sudakin, V. Chfr regulates a mitotic stress pathway through its RING-finger domain with ubiquitin ligase activity. Cancer Res. 62 (6), 1797-1801 (2002).
- Olaussen, K. a., Commo, F. Synergistic proapoptotic effects of the two tyrosine kinase inhibitors pazopanib and lapatinib on multiple carcinoma cell lines. Oncogene. 28 (48), 4249-4260 (2009).
- Reingewertz, T. H., Britan-Rosich, E. Mapping the Vif–A3G interaction using peptide arrays: A basis for anti-HIV lead peptides. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (12), 3523-3532 (2013).
- Katz, C., Benyamini, H. Molecular basis of the interaction between the antiapoptotic Bcl-2 family proteins and the proapoptotic protein ASPP2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12277-12282 (2008).
- Katz, C., Zaltsman-Amir, Y., Mostizky, Y., Kollet, N., Gross, A., Friedler, A. Molecular Basis of the Interaction between Proapoptotic Truncated BID (tBID) Protein and Mitochondrial Carrier Homologue 2 (MTCH2) Protein: KEY PLAYERS IN MITOCHONDRIAL DEATH PATHWAY. Journal of Biological Chemistry. 287 (18), 15016-15023 (2012).
- Rosenberg, M. M., Ronen, D., Lahav, N., Nazirov, E., Ravid, S., Friedler, A. High resolution characterization of myosin IIC tailpiece and its effect on filament assembly. Journal of Biological Chemistry. 288 (14), 9779-9789 (2013).
