Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.
אינטראקציות בין חלבונים לתווך את רוב התהליכים בתא הומאוסטזיס ושליטה חיים של האורגניזם. אינטראקציות חלבון פגומות עלולות לגרום למחלה, מה שהופך את אינטראקציות חלבון מטרה לתרופות חשובות. מכיוון שכך, חשוב מאוד להבין האינטראקציות הללו ברמה המולקולרית. אינטראקציות חלבון נלמדות תוך שימוש במגוון של טכניקות הנעות בין מבחני סלולריים וביוכימיים למבחנים ביו-פיסיקליים כמותי, ואלה עשויים להתבצע גם עם חלבונים באורך מלא, עם תחומים חלבון או עם פפטידים. פפטידים לשמש כלי מצוין כדי לחקור אינטראקציות חלבון שכן הוא יכול להיות מסונתזים פפטידים בקלות ולאפשר התמקדות באתרי אינטראקציה ספציפיות. מערכי פפטיד יאפשר זיהוי של אתרי האינטראקציה בין שני חלבונים, כמו גם הקרנה לפפטידים שנקשרים חלבון המטרה למטרות טיפוליות. הם גם מאפשרים מחקרי SAR תפוקה גבוהה. לזיהוי אתרי קישור, typiמערך פפטיד קאל מכיל בדרך כלל חופף חלקית 10-20 פפטידים שאריות נגזרים מהרצפים מלאים של חלבונים אחד מבני זוג או יותר של חלבון המטרה הרצויה. הקרנת המערך לכריכה חלבון המטרה מגלה פפטידים המחייבים, המקביל לאתרי הקישור בחלבונים הדומים, בשיטה קלה ומהירה רק באמצעות כמות קטנה של חלבון.
במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול להקרנת מערכי פפטיד למיפוי אתרי האינטראקציה בין חלבון מטרה ושותפיה. מערך פפטיד נועד מבוסס על הרצפים של חלבוני השותף לוקחים בחשבון מבנים משניים שלהם. מערכי שימוש בפרוטוקול זה היו מערכי Celluspots שהוכנו על ידי מכשירי Bioanalytical INTAVIS. המערך חסום כדי למנוע נוקבים מחייבים ולאחר מכן הודגרו עם החלבון הנחקר. זיהוי באמצעות נוגדן חושף פפטידים מחייבים המתאימים לאתרי אינטראקציה הספציפיים בין החלבונים.
אינטראקציות בין חלבונים לתווך את רוב התהליכים בתא החי. אינטראקציות חלבון פגומות עלולות לגרום למחלה, מה שהופך את אינטראקציות חלבון מטרה לתרופות חשובות. מכיוון שכך, חשוב מאוד להבין האינטראקציות הללו ברמה המולקולרית. אינטראקציות חלבון נלמדות תוך שימוש במגוון של טכניקות הנעות בין מבחני סלולריים וביוכימיים למבחנים ביו-פיסיקליים כמותי, ואלה עשויים להתבצע גם עם חלבונים באורך מלא, עם תחומים חלבון או עם פפטידים. פפטידים לשמש כלי מצוין כדי לחקור אינטראקציות חלבון. סיבה לכך הוא פפטידים יכולים להיות מסונתזים בקלות ולאפשר התמקדות באתר אינטראקציה ספציפית מצד אחד, ועל מטרות חלבון מרובות באופן תפוקה גבוהה על יד 1,2 האחר. הקרנת מערך פפטיד היא מהיר, קל לביצוע בשיטה לקבלת כמות גדולה של נתונים על האינטראקציות של חלבון מטרה עם שותפים רבים בזמן קצר 3. שלא כמו שיטות ביוכימיות או ביו-פיסיקליות אחרות לאיתור וניתוח אינטראקציות בין חלבונים, הקרנת מערך פפטיד דורשת ריכוז נמוך מאוד של חלבון והוא יכול לזהות חלש מאוד מחייב. מערכי פפטיד יכולים לשמש ליישומים רבים באינטראקציות פפטיד חלבון כגון מיפוי חלבונים או אתרי האינטראקציה קולטן ליגנד 4, ממשקים שָׁוֶה או הטרו-oligomerization של, נוגדנים המאפיינים epitopes 5, לומדים פעילויות אנזים 6 ותפוקה גבוהה structure- יחסי פעילות (SAR) לומדים 7. לבחינה מעמיקה על הקרנת מערך פפטיד לראות כץ ואח '. 4
מספר סוגים של מערכי פפטיד קיימים כיום. ישנן שתי אסטרטגיות עיקריות סינתטיות להכנת מערכי פפטיד: סינתזה של פפטידים לפני צירופם התמיכה המוצקה, או הסינתזה של פפטידים ישירות על התמיכה המוצקה, בעיקר באמצעות 4,8 טכניקת SPOT.פפטידים מסונתזים על התמיכה המוצקה בדרך כלל על ידי 9-fluorenylmethyloxycarbonyl כימיה (Fmoc) 8. בין התוכניות סינתטיות הנפוצות קובץ מצורף פפטיד דרך התחנה הסופית N (למשל, מערכי pepstar JPT 9) וקובץ מצורף פפטיד דרך התחנה הסופית C הם (למשל, מערכי pepchip PEPSCAN 10, מערכי JPT pepspot 9 ומערכי celluspot INTAVIS 11) 4. התמיכה המוצקה יכולה להשתנות וכך גם הכימיה של צימוד פפטיד אליו. יכולים להיות מחוברים פפטידים הופסקו-Cys שקופיות זכוכית באמצעות קבוצת תיאול 12. התחנה הסופית N של פפטיד יכולה להיות מחויבת קוולנטית לקבוצת הידרוקסיל על הקרום תאית באמצעות esterification של חומצת אמינו מחובר 8.
כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לסינון מערכי פפטיד כשיטה לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון. המערך השתמשנו הוא מערך Celluspots, שהוא מיקרו-מערך המכיל amo הגדולUNT של כתמים (כפילויות של עד 384 נקודות) על קרום תאית קטן הנתמכים על ידי שקופית זכוכית. זה מאפשר עבודה עם כמויות נמוכות של חלבון ונוגדנים וקבלת כמות משמעותית של נתונים לכל ניסוי בודד. מערך זה מכיל גם צפיפות פפטיד גבוהה המאפשרת זיהוי של זיקה נמוכה מחייבת. המערך שימש למיפוי האינטראקציה Stil-CHFR, וזה חשוב מאוד לשליטה בתא נורמלי התפשטות 13. אינטראקציה בלתי מבוקרת בין שני החלבונים יכולה להוביל להתפתחות הסרטן. על ידי מיפוי אינטראקציה זו שמצאנו את אתר הקישור הספציפי ומחייבים שאריות 14. זו סוללת את הדרך לעיצוב מעכבים רציונאליים המעכבים אינטראקציה חלבון-חלבון זה.
הקרנת מערך פפטיד היא כלי מצוין לזיהוי אתרי הקישור של חלבון מטרה בשותפיה. assay זה הוא מהיר וקל לביצוע וניתן לקבל תוצאות באחד או שני ימי עבודה. הקרנת מערך פפטיד היא תכליתית ויכולה לשמש למטרות רבות. ניתן להשתמש בו לאפיון שינויי תרגום פוסט כגון זרחון וזיהוי מצעים של קינאזו?…
The authors have nothing to disclose.
AF נתמכה על ידי מענק החל ממועצת המחקר האירופית תחת שביעי תכנית המסגרת של הקהילה האירופית (FP7 / 2007-2013) / הסכם ERC גרנט N ° 203,413 ועל ידי מרכז מינרבה לביו-היברידי systems.HA המורכב וAI נתמך על ידי דליה ודן מידן המלגה לסטודנטים לתואר מתקדם באוניברסיטת עברית בירושלים.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
His-probe Antibody (H-3) HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-8036 HRP | |
EZ-ECL Kit | Biological industries | 20-500-120 | |
Skim Milk | Becton, Dickinson and Company | 232100 | |
LAS-3000 camera | FUJI film |