의 라이브 영상<em> 초파리</em> 번데기 눈
Summary
This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.
Abstract
초파리 번데기 개발의 고유 프로세스는 이동 및 라이브 세포 이미징 동안 추적 개별 셀 동작을 어렵게 방법으로 눈의 상피 세포를 왜곡 할 수 있습니다. 이러한 프로세스는 다음과 같습니다 망막 회전, 세포의 성장과 생명체의 움직임을. 번데기가이 도전 하나의 초점면에서 몇 ommatidia, 개안 이상의 포커스에있는 이미지를 수집 할 수 있도록, 이미징을위한 준비로서 또한, 미묘한 범프 등 상피의 토폴로지, 불규칙 자주 소개 주름입니다. 워크 플로는 초파리 번데기 눈 개발하는 동안 세포 과정의 쉬운 분석을 가능하게 구제 여기 이러한 문제를 설명했다. 적절하게 준비된 번데기 용이 대부분 실험실에서 조립 될 수 촬상 장비에 배치되어 유비퀴틴 DE 카데 :. GFP와 GMR-GAL4 구동 형 UAS-α 카테닌 : GFP를 눈 상피 1 셀 경계를 시각화하는데 사용 -3입니다. 디컨 볼 루션은 후다중 초점면에서 촬영 된 형광 화상에 적용된 최대 투사 화상은 각 시점에 대해 생성 및 편집 소프트웨어를 사용하여 강화된다. 정렬 알고리즘은 추적 할 개별 셀의 동작은 더 쉽게, 빠르게 불필요한 움직임을 안정화하는 데 사용됩니다.
Introduction
화합물 초파리의 눈은 액세서리 색소 세포 4,5의 벌집 격자로 구분하여 그 ~ 750 ommatidia, 개안의 틀에 박힌 배열을 특징으로한다. 로컬 셀 움직임 세포 성장, 세포 형상의 변화, 세포 사멸 이러한 색소 세포는 이벤트 코디 조합에 의해 패터닝된다. 이 상피 세포의 실시간 시각화 하나는 생리 학적으로 적절하고 교란 입체 맥락에서 이러한 이벤트를 뒷받침하는 분자 메커니즘을 연구 할 수 있습니다.
이전의 프로토콜 -6,7- 대조적으로, 여기에 설명 된 기술들은 화상 형성 공정에서 커플 해제 할 수없는 불필요한 조직의 움직임을 안정화시키기위한 효율적인 방법을 포함한다. 영상의 과정을 통해, 성장 회전하는 조직과 변화 -이 방법은 개발 초파리 번데기 눈 상피 세포 행동의 연구를 강화한다. 또한 모션 안정화 기술에서는 드여기에 스 크라이 빙 외부 이동되기 다른 상황에서 세포를 연구하는 데 유용 할 것입니다.
눈 특정 드라이버 GMR-GAL4 1-3의 통제하에 GFP : GFP뿐만 아니라 UAS-α-catenin의를 : 초파리 망막 분야에서 셀 경계를 시각화하기 위해 유전자 변형 플라이 라인은 UBI-DE-cadherin의 발현가 생성되었다. 두 GFP 태그가 막 마커의 사용은 낮은 강도의 빛 셀 경계의 시각화 수 있습니다. 이는 고 에너지의 파장에 반복 노출 활성화, 증가 된 프레임 레이트 및 동영상 구간에 조직 손상을 최소화하고 광표백. UAS-DCR-2는 제 2 플라이 라인 (8)에 통합되었다의 RNAi 유전자의 효능을 강화합니다.
이전의 프로토콜의 세 번째 업데이트에서는 실험실에서 가장 용이하게 조립된다 촬상 간단한 장비를 설명한다. 이 장치는 특수 촬상 R을 갖도록 요구를 미연에 방지IG는 대학의 '기계 공장'또는 이와 유사한 서비스에 의해 생성. 이 영상 장비는 이미지를 다른 번데기 조직 9, 10에 사용되는 것과 유사하다.
직접 17-42 시간 puparium 형성 HR (APF) ~ 후 안구로부터 패터닝에 기여 형태 발생 이벤트를 평가하기 위해 사용될 수있는 단순한 라이브 셀 이미징 프로토콜이 여기에 제시했다. 즉,이 프로토콜은 번데기 개발 중에 유전자 발현을 변경하는 결과를 결정하기 위해 하나를 가능하게한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
야생형 개발 위의 설명은 RNAi의 패터닝에서 이벤트 또는 과발현 유전자형의 비교를위한 기초를 형성한다. 세포의 행동이 관심의 단백질에 의해 조절되는 정확하게 결정할 때 라이브 조직 개발의 비교는 매우 중요하다. 또한, 설명을 생략하고, 생균 촬상 한 그 패턴 눈 이벤트에 관심 유전자의 역할을 정 성적 및 / 또는 정량적으로 설명을 할 수있다. 30 ~ 32 시간의 APF으로 대부분의 색소 세포가 안?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank David Larson for developing the original protocol for imaging the live Drosophila pupal eye. We thank our colleagues Richard Carthew, Shoichiro Tsukita and Matthew Freeman, who developed the transgenic flies that we combined to generate our live-imaging fly lines. Brittany Baldwin-Hunter gave helpful comments on the manuscript. This work was supported by start-up funds awarded to Ruth Johnson by Wesleyan University.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| Scotch double stick tape | 3M | 665 | |
| Black Sylgard dissection dish | Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 h to polymerize | ||
| Sylgard | Dow Corning | SYLG184 | |
| Sylgard (Black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Glass petri dish | Corning | 7220-85 | |
| 25 x 75 x 1 mm glass microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| 22 x 40 mm glass coverslip | VWR | 48393-172 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Whatman 3mm Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-713-336 | |
| Vaseline | Fisher Scientific | 19-086-291 | Or purchase at local pharmacy. |
| 30ml syringe | Fisher Scientific | S7510-30 | |
| Adobe Photoshop CS5 | Adobe | ||
| Leica TCS SP5 DM microscope | Leica Microsystems | ||
| LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software | Leica Microsystems | ||
Riferimenti
- Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).
- Oda, H., Tsukita, S. Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein. Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Cagan, R. Cell fate specification in the developing Drosophila. retina. Dev Suppl. , 19 (1993).
- Wolff, T., Ready, D. F., Bate, M., Arias, A. M. Pattern formation in the Drosophila. retina. The Development of Drosophila melanogaster. , 1277-1325 (1993).
- Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing. Drosophila pupal retina. Mech. Dev. 125, 223-234 (2008).
- Monserrate, J. P., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death Differ. 14, 209-217 (2007).
- Lee, Y. S., et al. Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways. Cell. 117, 69-81 (2004).
- Zitserman, D., Roegiers, F. Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae. J. Vis. Exp. (51), 2706 (2011).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).
- Sato, M., Suzuki, T., Nakai, Y. Waves of differentiation in the fly visual system. Dev. Biol. 380, 1-11 (2013).
- Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).
- Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye. PLoS Comput. Biol. 6, e1000841 (2010).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina. Genes Dev. 1099, 1112 (1989).
- Miller, D. T., Cagan, R. L. Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina. Development. 125, 2327-2335 (1998).
- Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development. Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).
- Yu, S. Y., et al. A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye. Development. 129, 3269-3278 (2002).
- Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).
- Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation. Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).
