Live-визуализация<em> Drosophila</em> Куколки глаз
Summary
This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.
Abstract
Врожденные процессы развития Drosophila куколки могут смещаться и искажать глаз эпителий способами, которые делают индивидуальное поведение клеток трудно отследить во время съемки живых клеток. Эти процессы включают в себя: сетчатки вращение, рост клеток и организменном движение. Кроме того, нарушения в топологии эпителия, в том числе тонких ударов и складки часто вводят в куколки получают для работы с изображениями, сделать это сложно приобрести в фокусе изображения более чем на несколько омматидиев в одном фокальной плоскости. Рабочий процесс описанный здесь исправляет эти вопросы, что позволяет легко анализировать клеточных процессов во время Drosophila развития куколки глаз. Соответственно, в постановке куколки расположены в буровой изображений, которые можно легко собрать в большинстве лабораторий убиквитин-ДЕ-кадгерин:. GFP и ГМР-GAL4 управляемом БАС-α-катенин: GFP используются для визуализации границ клеток в эпителии глаз 1 -3. После деконволюцииприменяется для флуоресцентных изображений, снятых при нескольких фокальных плоскостях, максимальный выступ изображения создаются для каждого момента времени и улучшено с использованием редактирования изображений программное обеспечение. Выравнивание алгоритмы используются для быстрого стабилизации лишнего движения, что делает индивидуальное поведение клеток легче отслеживать.
Introduction
Соединение дрозофилы глаз характеризуется стереотипной расположения его ~ 750 омматидиев разделенных сотовой решетки-вспомогательных пигментных клеток 4,5. Эти пигментные клетки с рисунком с помощью согласованной комбинации событий: местных движений клеток, клеточного роста, изменение формы клеток и апоптоз. Живая визуализация этого эпителия позволяет изучать молекулярные механизмы, лежащие в основе этих событий в физиологически необходимой и невозмущенной трехмерной контексте.
В отличие от предыдущих протоколов 6,7, методика описано здесь, включает в себя эффективный способ стабилизации посторонние движение ткани, которая не может быть отсоединен от процесса формирования изображения. Этот способ повышает исследований поведения клеток в развивающемся Drosophila куколки глаз эпителия – ткани, который растет, вращается, и сдвиги в течение визуализации. Кроме того движение стабилизация техника деописано здесь, будет полезным для изучения клеток и в других контекстах, где происходит постороннее движение.
Для визуализации границ клеток сетчатки в области Drosophila, трансгенные линии мух, которые были получены выражения Ubi-ДЕ-кадгерин: GFP, а также UAS-α-катенин: GFP под контролем водителя глаз конкретного ГМР-GAL4 1-3. Использование двух GFP-меченый мембранных маркеров позволяет для визуализации границ клеток в нижней интенсивности света. Это сводит к минимуму повреждения тканей и фотообесцвечивание на повторном воздействии высоких энергий длин волн, позволяя увеличенную частоту кадров и продолжительности фильма. Для повышения эффективности RNAi трансгенов, UAS-DCR-2 также включены во второй летучей линии 8.
В третьем обновления из предыдущих протоколов, простой визуализации буровой которые легко собран в большинстве лабораторий описано. Этот аппарат устраняет требование, чтобы иметь специализированный изображений RIG генерируется университета "механический цех" или подобный сервис. Это визуализации установка аналогична той, что используется в графических других куколок тканей 9,10.
Представленные здесь простой протокол изображения живых клеток, которые могут быть использованы непосредственно оценить морфогенетические события, которые способствуют глаз паттерна от ~ 17 до 42 ч после образования пупария (HR НПФ). В частности, этот протокол позволяет определить последствия изменения экспрессии генов во время развития куколки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описание разработки дикого типа (выше) образует основу для сравнения паттерна событий в РНК-интерференции или избыточной экспрессии генотипов. Сравнение развития живой ткани имеют неоценимое значение при определении, какие именно клеточные поведения регулируются белка. Кроме того, и…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank David Larson for developing the original protocol for imaging the live Drosophila pupal eye. We thank our colleagues Richard Carthew, Shoichiro Tsukita and Matthew Freeman, who developed the transgenic flies that we combined to generate our live-imaging fly lines. Brittany Baldwin-Hunter gave helpful comments on the manuscript. This work was supported by start-up funds awarded to Ruth Johnson by Wesleyan University.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| Scotch double stick tape | 3M | 665 | |
| Black Sylgard dissection dish | Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 h to polymerize | ||
| Sylgard | Dow Corning | SYLG184 | |
| Sylgard (Black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Glass petri dish | Corning | 7220-85 | |
| 25 x 75 x 1 mm glass microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| 22 x 40 mm glass coverslip | VWR | 48393-172 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Whatman 3mm Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-713-336 | |
| Vaseline | Fisher Scientific | 19-086-291 | Or purchase at local pharmacy. |
| 30ml syringe | Fisher Scientific | S7510-30 | |
| Adobe Photoshop CS5 | Adobe | ||
| Leica TCS SP5 DM microscope | Leica Microsystems | ||
| LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software | Leica Microsystems | ||
Riferimenti
- Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).
- Oda, H., Tsukita, S. Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein. Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Cagan, R. Cell fate specification in the developing Drosophila. retina. Dev Suppl. , 19 (1993).
- Wolff, T., Ready, D. F., Bate, M., Arias, A. M. Pattern formation in the Drosophila. retina. The Development of Drosophila melanogaster. , 1277-1325 (1993).
- Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing. Drosophila pupal retina. Mech. Dev. 125, 223-234 (2008).
- Monserrate, J. P., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death Differ. 14, 209-217 (2007).
- Lee, Y. S., et al. Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways. Cell. 117, 69-81 (2004).
- Zitserman, D., Roegiers, F. Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae. J. Vis. Exp. (51), 2706 (2011).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).
- Sato, M., Suzuki, T., Nakai, Y. Waves of differentiation in the fly visual system. Dev. Biol. 380, 1-11 (2013).
- Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).
- Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye. PLoS Comput. Biol. 6, e1000841 (2010).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina. Genes Dev. 1099, 1112 (1989).
- Miller, D. T., Cagan, R. L. Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina. Development. 125, 2327-2335 (1998).
- Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development. Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).
- Yu, S. Y., et al. A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye. Development. 129, 3269-3278 (2002).
- Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).
- Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation. Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).
