Summary

في تحليل المختبر من الاستجابة المناعية الخلوية بوساطة Myd88 لفيروس غرب النيل المسخ سلالة العدوى

Published: November 27, 2014
doi:

Summary

Two flow cytometry-based methods – an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

Abstract

فيروس غرب النيل الموهن (بحمى غرب النيل)، وابنيوي (NS) 4B-P38G متحولة، التي يسببها خلوى أعلى الفطري واستجابات الخلايا T من النوع البري بحمى غرب النيل في الفئران. في الآونة الأخيرة، النخاعي عامل التمايز 88 تم عرض (MyD88) يشير إلى أن تكون مهمة لالأولي فتيلة الخلايا T والتنمية خلية ذاكرة T خلال بحمى غرب النيل NS4B-P38G العدوى متحولة. في هذه الدراسة، وهما تتدفق على أساس أساليب الخلوي – في المختبر T خلية فتيلة فحص وتلطيخ خلوى داخل الخلايا (ICS) – استخدمت لتقييم الخلايا الجذعية (DCS) وظائف الخلايا التائية. في الخلية T فتيلة الفحص، تم تحليل تكاثر الخلايا التدفق الخلوي التالية ثقافة مشتركة من البلدان النامية من كلا المجموعتين من الفئران مع استر carboxyfluorescein succinimidyl (CFSE) – وصفت خلايا CD4 + T OTII من الفئران المعدلة وراثيا. قدم هذا النهج تحديد دقيق لنسبة تكاثر الخلايا CD4 + T مع تحسن كبير في الحساسية الشاملة من التقليدآل المقايسات مع الكواشف الإشعاعية. تم استخدام نظام أنبوب microcentrifuge في كل إجراءات زراعة الخلايا وتلطيخ خلوى البروتوكول ICS. بالمقارنة مع النظام القائم على لوحة زراعة الأنسجة التقليدية، وكان هذا الإجراء تعديل أسهل للأداء على المستوى السلامة الأحيائية (BL) 3 المرافق. وعلاوة على ذلك، تم علاج WNV- الخلايا المصابة مع امتصاص العرق في كل من المقايسات، والتي مكنت مزيد من التحليل خارج مرافق BL3. عموما، هذه المقايسات المناعية في المختبر يمكن استخدامها لتقييم كفاءة الاستجابات المناعية الخلوية خلال العدوى بحمى غرب النيل.

Introduction

فيروس غرب النيل (بحمى غرب النيل)، وهو موجه للعصب، بالإضافة إلى لمست-الفيروسة المصفرة، يشكل تهديدا للصحة العامة الناشئة. حاليا، وقد تمت الموافقة على أي لقاحات للاستخدام البشري 1. سلالة بحمى غرب النيل الموهن، التي لديها إجراء تبديل P38G في ابنيوي (NS) البروتين 4B، ومن المعروف للحث على أي الفتك في الفئران ولكن السيتوكينات أعلى الفطرية واستجابات الخلايا T في الفئران من النوع البري بحمى غرب النيل NY99 سلالة 2. تحصين الفئران مع متحولة NS4B-P38G كانت كلها محمية من التحدي الثانوي مع قاتلة من النوع البري بحمى غرب النيل. وهذا يوحي بأن متحولة NS4B-P38G لديها ميزات مناسبة لمرشح اللقاح المثالي. الآليات التي متحولة NS4B-P38G يدفع عالية على التكيف الحصانة الواقية ليست مفهومة بشكل واضح حتى الان. تول مثل مستقبلات (TLRs)، والتي تعترف أنماط الجزيئية المرتبطة الممرض، وتلعب دورا أساسيا في الشروع في المناعة الفطرية للعدوى الفيروسية. مسار الأساسية TLR إشارات يستخدم استجابة التمايز الابتدائي الدم النخاعي جنرال الكتريكشمال شرق 88 (MyD88) كما محول الأساسي 3،4. في دراسة حديثة، تبين MyD88 الإشارات للعب دورا هاما في تطوير خلايا مناعة بوساطة خلال العدوى بحمى غرب النيل متحولة NS4B- P38G في الفئران 5. خلايا تغصنية (DCS) هي واحدة من الخلايا العارضة للمستضد أهم واظهار قدرة فريدة لبدء T الأساسي استجابات الخلايا خلال العدوى الفيروسية 6،7. CD4 + CD8 + T والخلايا على حد سواء يساهم في مناعة وقائية طويلة الأمد ومهمة من أجل البقاء المضيف التالية من النوع البري الإصابة بحمى غرب النيل 8،9. واستخدمت اثنين من المقايسات المناعية في هذه الدراسة لتقييم وظائف هذه الخلايا في NS4B-P38G متحولة إصابة الفئران.

أولا، تم استخدام وفتيلة فحص في المختبر T الخلية لمقارنة قدرة العارضة للمستضد من البلدان النامية من المصابين بحمى غرب النيل من النوع البري وMyD88 – / – الفئران. لزيادة حساسية الفحص، ساذج CD4 <سوب> + تم عزل خلايا T OTII من الفئران المعدلة وراثيا والتي تعبر محددة Vα2 / Vβ5 TCR للألبومين البيض والدجاج (OVA) الببتيد 323 – 339. وتنقيته من البلدان النامية بحمى غرب النيل الفئران المصابة، وشارك في تربيتها مع carboxyfluorescein succinimidyl عيد الفصح (CFSE ) -labeled خلايا CD4 + T في وجود OVA الببتيد. بعد 5 أيام من شارك في الثقافة، وكان حصاد الخلايا وثابتة مع بارافورمالدهيد (PFA) وتحليلها من قبل التدفق الخلوي. وقد أجريت فحوصات التكاثري تقليديا من خلال إدماج 5-برومو-2'-deoxyuridine (BrdU) أو معالج بالتريتيوم ديوكسي ريبوزيد الثايمين (3 HTdr) 10. ومع ذلك، فإن هذه المقايسات إما المشعة و / أو في حاجة إلى معدات خاصة على مستوى السلامة الأحيائية (BL) 3 المرافق، حيث يتم إجراء دراسات بحمى غرب النيل. تحليل تدفق cytometric من انتشار الخلايا اللمفاوية التي كتبها بمقدار النصف التسلسلي للكثافة مضان من صبغ الحيوي أصبح CFSE أكثر شيوعا المستخدمة في المقايسات المناعية كما أن الصبغة هي أكثر ثابتوأدرجت بالتساوي في الخلايا، والكشف بسهولة عن طريق التدفق الخلوي، وغير امشع 11. لديه الفحص أيضا القدرة على تقييم عدد من انقسامات الخلية. واحد الميزة الرئيسية لاستخدام هذا الاختبار في الدراسات بحمى غرب النيل هو أن تثبيت للخلايا المصابة 1-2٪ PFA يمكن إبطال مفعول بحمى غرب النيل 12، مما سيمكن الحصول على عينة مع تدفق عداد الكريات في مختبر BL2.

وبعد ذلك، تم استخدام إجراء تعديل الخلايا تلطيخ خلوى (ICS) لدراسة دور MyD88 الإشارات في تنظيم بحمى غرب النيل استجابات الخلايا T محددة في NS4B-P38G الفئران المصابة متحولة. في هذا الاختبار، وعولج splenocytes معزولة عن الفئران المصابة بحمى غرب النيل في المختبر مع الببتيدات محددة. وأضيف Brefeldin والإبقاء على السيتوكينات داخل الخلية. بعد 5 ساعة الحضانة، تم حصاد الخلايا، وغسلها وملطخة للT مجموعات فرعية الخلية. تم خلايا ثم ثابتة في PFA، permeabilized وملطخة للفيروسات (IFN) -γ وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي.كما هو الحال مع غيرها من تدفق الفحص القائمة على الخلوي، مرة واحدة يتم التعامل مع الخلايا مع تثبيت وعازلة permeabilization تحتوي على PFA، والعينات المصابة يمكن نقلها إلى مختبر BL2 لمزيد من المعالجة والتحليل. في العديد من الدراسات المنشورة، وقد استخدمنا ICS لقياس وظائف T المستجيب الخلايا في الفئران المصابة بحمى غرب النيل 13،14. على الرغم من انها راسخة، عيب رئيسي واحد من هذا الاختبار هو أن هذا الإجراء هو طويل جدا ويمكن أن يكون أكثر استهلاكا للوقت عندما يؤديها داخل مرافق BL3. هنا، تبين وجود طريقة ICS أساس أنبوب الطرد المركزي الصغيرة لتكون أكثر جدوى، وأسهل على المضي قدما وأقل استهلاكا للوقت عندما تتم داخل مختبر BL3.

Protocol

وتمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان في جامعة تكساس الفرع الطبي. 1. عزل البلدان النامية من الفئران غير المصابة والمصابين بحمى غرب النيل مباراة السن…

Representative Results

في فحص الخلايا التائية فتيلة، كانت CFSE المسمى خلايا CD4 + T مثقف مع البلدان النامية المنقى من NS4B-P38G المصابة متحولة من النوع البري وMyD88 – / – الفئران في وجود أو عدم وجود الببتيدات OVA. خلايا T وصفت مثقف وحدها مع أو بدون OVA لتم استخدام 5 أيام والضوابط السلبية. كما هو مب…

Discussion

بحمى غرب النيل هو الممرض BL3. بسبب لوائح السلامة والمقايسات المناعية مع عينات المصابة بحمى غرب النيل وغالبا ما تقتصر من قبل توافر المعدات في BL3 مرافق أو أكثر طويلة ومملة لأداء. في دراسة حديثة، استخدمنا طريقتين القائم على التدفق الخلوي لدراسة الخلية بوساطة الاستجابات ا…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by NIH grants to T.W. (R01AI072060 and R01AI099123). G. Xie was supported by a Sealy Center for Vaccine Development Predoctoral Fellowship. We thank Dr. Richard Flavell (Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven) and Dr. Shizuo Akira (Osaka University, Japan) for providing the MyD88/ mice and Dr. Y Cong (UTMB, Galveston) for providing OTII transgenic mice.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
RPMI 1640 Invitrogen 11875 warm up at 37C
anti-CD11c magnetic beads  Miltenyi Biotec 130-052-001 follow the manufacturer’s instructions
anti-CD4 magnetic beads  Miltenyi Biotec 130-095-248 follow the manufacturer’s instructions
CFSE Invitrogen C34554
OVA residue 323-339 Genscript Corporation RP10610
Peptides Proimmune PC0AD-D
Brefeldin A solution BD Bioscience 555029
Mouse Fc Blocker e-Bioscience 14-0161-85
APC-conjugated CD4  e-Bioscience 17-0041-81
FITC-conjugated CD8  e- bioscience 11-0081-82
Fixation/Permeabilization Solution BD- Bioscience 554722
Permeabilization/wash buffer BD- Bioscience 554723
anti-IFNg-PE  e-Bioscience 12-7311-82
Accuri flow cytometer BD Bioscience

Riferimenti

  1. Campbell, G. L., Marfin, A. A., Lanciotti, R. S., Gubler, D. J. West Nile virus. Lancet Infect. Dis. 2, 519-529 (2002).
  2. Welte, T., et al. Immune responses to an attenuated West Nile virus NS4B-P38G mutant strain. Vaccine. 29, 4853-4861 (2011).
  3. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Toll-like receptor control of the adaptive immune responses. Nat. Immunol. 5, 987-995 (2004).
  4. Akira, S., Hemmi, H. Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family. Immunol. Lett. 85, 85-95 (2003).
  5. Xie, G., et al. A West Nile virus NS4B-P38G mutant strain induces adaptive immunity via TLR7-MyD88-dependent and independent signaling pathways. Vaccine. 31 (38), 4143-4151 (2013).
  6. Fang, H., et al. gammadelta T cells promote the maturation of dendritic cells during West Nile virus infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 59, 71-80 (2010).
  7. Silva, M. C., Guerrero-Plata, A., Gilfoy, F. D., Garofalo, R. P., Mason, P. W. Differential activation of human monocyte-derived and plasmacytoid dendritic cells by West Nile virus generated in different host cells. J. Virol. 81, 13640-13648 (2007).
  8. Shrestha, B., Samuel, M. A., Diamond, M. S. CD8+ T Cells Require Perforin To Clear West Nile Virus from Infected Neurons. J. Virol. 80, 119-129 (2006).
  9. Wang, Y., Lobigs, M., Lee, E., Mullbacher, A. CD8+ T cells mediate recovery and immunopathology in West Nile virus encephalitis. J. Virol. 77, 13323-13334 (2003).
  10. Plebanski, M., Katsara, M., Sheng, K. C., Xiang, S. D., Apostolopoulos, V. Methods to measure T-cell responses. Expert Rev. Vaccines. 9, 595-600 (2010).
  11. Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
  12. Kraus, A. A., Priemer, C., Heider, H., Kruger, D. H., Ulrich, R. Inactivation of Hantaan virus-containing samples for subsequent investigations outside biosafety level 3 facilities. Intervirology. 48, 255-261 (2005).
  13. Saxena, V., et al. A hamster-derived west nile virus isolate induces persistent renal infection in mice. PLoS Negl. Trop. Dis. 7, 2275 (2013).
  14. Welte, T., et al. Vgamma4+ T cells regulate host immune response to West Nile virus infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 183-192 (2011).
check_url/it/52121?article_type=t

Play Video

Citazione di questo articolo
Xie, G., Whiteman, M. C., Wicker, J. A., Barrett, A. D., Wang, T. In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection. J. Vis. Exp. (93), e52121, doi:10.3791/52121 (2014).

View Video