In Vitro анализ MyD88-опосредованной клеточного иммунного ответа на вирус Западного Нила мутантный штамм инфекции
Summary
Two flow cytometry-based methods – an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.
Abstract
Ослабленных вирусов Западного Нила (WNV), неструктурных (NS), 4B-P38G мутант, индуцированной выше врожденную цитокинов и Т-клеточный ответ, чем дикого типа у мышей WNV. Недавно миелоидной фактор дифференциации 88 (MyD88) сигналов было показано, что важно для первоначального грунтовки Т-клеток и развитие Т-клеток памяти во WNV NS4B-P38G мутантного инфекции. В этом исследовании две течь методы, основанные на цитометрии – в пробирке Т-клеток грунтовки анализа и внутриклеточного окрашивания цитокинов (ICS) – были использованы для оценки дендритные клетки (DC) и функции Т-клеток. В Т-клетки заливной анализа, пролиферации клеток анализировали с помощью проточной цитометрии после совместного культуры ДК с обеих группах мышей с карбоксифлуоресцеин сукцинимидил эфира (CFSE) – помечены CD4 + Т-клетки OTII трансгенных мышей. Такой подход обеспечил точное определение процента пролиферирующих лимфоцитов CD4 + Т-клеток со значительно улучшилось общее чувствительность, чем традицииаль-анализов с радиоактивными реагентами. Система микроцентрифужных трубки был использован как в культуре клеток, и цитокин окрашивания процедур протокола ICS. По сравнению с традиционной системой пластины на основе культуры ткани, этот модифицированный порядок проще было выполнить на уровне биобезопасности (BL) 3 объектов. Кроме того, WNV- инфицированные клетки обрабатывали параформальдегидом в обоих анализах, которые позволили дальнейшего анализа за пределами BL3 объектов. В целом, эти в пробирке иммунологические анализы могут быть использованы для оценки эффективного клеточно-опосредованные иммунные ответы в течение WNV инфекции.
Introduction
Вирус Западного Нила (ЛЗН), нейротропные, плюс зондирования флавивирус, является новым угрозу для здоровья населения. В настоящее время нет вакцины не были одобрены для использования человеком 1. Ослабляется WNV штамма, который имеет замену P38G в неструктурного (NS) 4B белка, как известно, не вызывают не летальность у мышей, но выше, врожденные цитокинов и Т-клеточный ответ у мышей, чем дикого типа штамма WNV NY99 2. Мышей, иммунизированных мутантом NS4B-P38G все были защищены от вторичного заражения летальной дикого типа WNV. Это говорит о том, что мутант NS4B-P38G имеет соответствующие возможности для кандидата в идеальном вакцины. Механизмы, посредством которых мутант NS4B-P38G индуцирует высокие защитные адаптивного иммунитета не ясно еще понял. Toll-подобные рецепторы (TLRs), которые распознают патоген-ассоциированные молекулярные паттерны, играют важную роль в инициации врожденного иммунитета к вирусной инфекции. Сигнальный путь TLR ядро использует миелоидный дифференциация первичного ответа GENE 88 (MyD88) в качестве основного адаптера 3,4. В недавнем исследовании, сигнализация MyD88 было показано, играют важную роль в развитии клеточный иммунитет во время ЛЗН NS4B- P38G мутанта инфекции у мышей 5. Dentritic клетки (ДК) являются одним из наиболее важных антиген-представляющих клеток, обладающих уникальной способности инициировать реакцию первичного Т-клеток при вирусной инфекции 6,7. CD4 + и CD8 + Т-клетки и способствуют длительной защитного иммунитета и имеют важное значение для выживания хозяина после дикого типа ЛЗН инфекции 8,9. Два иммунологические анализы были использованы в данном исследовании для оценки функции этих клеток у мутантных мышей, инфицированных NS4B-P38G.
Во-первых, грунтовки анализа в пробирке Т-клеток использовали для сравнения антиген-представляющих возможность ДКС WNV-инфицированных дикого типа и MyD88 – / – мышей. Для повышения чувствительности анализа, наивный CD4 <SUP> + Т-клетки были выделены из OTII трансгенных мышей, которые выражают специфику Vα2 / Vβ5 TCR для курицы яичного белка (OVA) пептид 323 – 339. ДК ЛЗН инфицированных мышей были очищены, и совместно культивировали с карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловый Пасхи (CFSE ) меченных CD4 + Т-клетки в присутствии пептида OVA. После 5 дней совместного культивирования клетки собирали и фиксировали параформальдегидом (PFA) и анализировали с помощью проточной цитометрии. Пролиферативные анализы традиционно осуществляется посредством включения 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU) или тритием тимина deoxyriboside (3) 10 HTdr. Тем не менее, эти анализы либо радиоактивных и / или нуждаются в специальных оборудования на уровне биобезопасности (BL) 3 объектов, где WNV исследования, проведенного. Анализ проточной цитометрии пролиферации лимфоцитов путем последовательного сокращения вдвое интенсивности флуоресценции витальным красителем CFSE стала более широко используется в иммунологических анализах, как краситель является более стабильнои равномерно включены в клетках, обнаруживается легко с помощью проточной цитометрии, и нерадиоактивных 11. Анализ также имеет возможность оценить количество клеточных делений. Одно из главных преимуществ использования этого теста в исследованиях ЛЗН, что фиксация инфицированных клеток с 1-2% PFA может инактивировать ЛЗН 12, что позволит приобретение пример с проточной цитометрии в BL2 лаборатории.
Далее, процедура модифицированного внутриклеточное окрашивание цитокинов (ICS) был использован для изучения роли MyD88 сигнализации в регуляции ЛЗН конкретных ответов Т-клеток в NS4B-P38G мутантных-инфицированных мышей. В этом анализе спленоцитов, выделенных из инфицированных мышей обрабатывали в пробирке с WNV конкретных пептидов. Брефелдин был добавлен, чтобы сохранить цитокинов в клетке. После 5 ч инкубации клетки собирали, промывали и окрашивали на Т-клеток подмножеств. Затем клетки фиксировали в PFA, проницаемыми и окрашивали в течение интерферона (IFN) -γ и анализировали с помощью проточной цитометрии.Как и в другом потоке анализа на основе цитометрии, когда клетки обрабатывают с фиксацией и пермеабилизации буфере, содержащем PFA, инфицированные образцы могут быть переданы в BL2 лаборатории для дальнейшей обработки и анализа. В нескольких опубликованных исследований, мы использовали ICS для измерения Т клеточных функций эффекторных в WNV-инфицированных мышей 13,14. Хотя это хорошо известно, один главный недостаток данного метода является то, что процедура очень длительная и может быть более трудоемким, когда выполняются внутри BL3 объектов. Здесь метод ИКС микро-центрифужные пробирки на основе было показано, что более реально, проще, чтобы продолжить и меньше времени, когда выполняется в BL3 лаборатории.
Protocol
Representative Results
Discussion
ЛЗН возбудитель BL3. В соответствии с правилами техники безопасности, иммунологические анализы с образцами WNV-инфицированных часто ограничиваются наличием оборудования на BL3 объектов или более длительным и утомительным для выполнения. В недавнем исследовании мы использовали два цитом…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grants to T.W. (R01AI072060 and R01AI099123). G. Xie was supported by a Sealy Center for Vaccine Development Predoctoral Fellowship. We thank Dr. Richard Flavell (Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven) and Dr. Shizuo Akira (Osaka University, Japan) for providing the MyD88–/– mice and Dr. Y Cong (UTMB, Galveston) for providing OTII transgenic mice.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | warm up at 37C |
| anti-CD11c magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | follow the manufacturer’s instructions |
| anti-CD4 magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-095-248 | follow the manufacturer’s instructions |
| CFSE | Invitrogen | C34554 | |
| OVA residue 323-339 | Genscript Corporation | RP10610 | |
| Peptides | Proimmune | PC0AD-D | |
| Brefeldin A solution | BD Bioscience | 555029 | |
| Mouse Fc Blocker | e-Bioscience | 14-0161-85 | |
| APC-conjugated CD4 | e-Bioscience | 17-0041-81 | |
| FITC-conjugated CD8 | e- bioscience | 11-0081-82 | |
| Fixation/Permeabilization Solution | BD- Bioscience | 554722 | |
| Permeabilization/wash buffer | BD- Bioscience | 554723 | |
| anti-IFNg-PE | e-Bioscience | 12-7311-82 | |
| Accuri flow cytometer | BD Bioscience |
Riferimenti
- Campbell, G. L., Marfin, A. A., Lanciotti, R. S., Gubler, D. J. West Nile virus. Lancet Infect. Dis. 2, 519-529 (2002).
- Welte, T., et al. Immune responses to an attenuated West Nile virus NS4B-P38G mutant strain. Vaccine. 29, 4853-4861 (2011).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Toll-like receptor control of the adaptive immune responses. Nat. Immunol. 5, 987-995 (2004).
- Akira, S., Hemmi, H. Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family. Immunol. Lett. 85, 85-95 (2003).
- Xie, G., et al. A West Nile virus NS4B-P38G mutant strain induces adaptive immunity via TLR7-MyD88-dependent and independent signaling pathways. Vaccine. 31 (38), 4143-4151 (2013).
- Fang, H., et al. gammadelta T cells promote the maturation of dendritic cells during West Nile virus infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 59, 71-80 (2010).
- Silva, M. C., Guerrero-Plata, A., Gilfoy, F. D., Garofalo, R. P., Mason, P. W. Differential activation of human monocyte-derived and plasmacytoid dendritic cells by West Nile virus generated in different host cells. J. Virol. 81, 13640-13648 (2007).
- Shrestha, B., Samuel, M. A., Diamond, M. S. CD8+ T Cells Require Perforin To Clear West Nile Virus from Infected Neurons. J. Virol. 80, 119-129 (2006).
- Wang, Y., Lobigs, M., Lee, E., Mullbacher, A. CD8+ T cells mediate recovery and immunopathology in West Nile virus encephalitis. J. Virol. 77, 13323-13334 (2003).
- Plebanski, M., Katsara, M., Sheng, K. C., Xiang, S. D., Apostolopoulos, V. Methods to measure T-cell responses. Expert Rev. Vaccines. 9, 595-600 (2010).
- Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
- Kraus, A. A., Priemer, C., Heider, H., Kruger, D. H., Ulrich, R. Inactivation of Hantaan virus-containing samples for subsequent investigations outside biosafety level 3 facilities. Intervirology. 48, 255-261 (2005).
- Saxena, V., et al. A hamster-derived west nile virus isolate induces persistent renal infection in mice. PLoS Negl. Trop. Dis. 7, 2275 (2013).
- Welte, T., et al. Vgamma4+ T cells regulate host immune response to West Nile virus infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 183-192 (2011).
