In Analisi Vitro di Myd88 mediata Cellular Immune Response to West Nile virus mutante Strain Infezione
Summary
Two flow cytometry-based methods – an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.
Abstract
Un virus attenuato West Nile (WNV), una non strutturale (NS) 4B-P38G mutante, indotta citochine superiore innata e le risposte delle cellule T rispetto al wild-type WNV nei topi. Recentemente, mieloide fattore di differenziazione 88 (MyD88) Segnalazione ha dimostrato di essere importante per priming di cellule T iniziale e lo sviluppo delle cellule di memoria T durante l'infezione WNV mutante NS4B-P38G. In questo studio, due flusso metodi basati citometria – una in vitro delle cellule T saggio di adescamento e una citochina colorazione intracellulare (ICS) – sono stati utilizzati per valutare le cellule dendritiche (DC) e funzioni delle cellule T. Nella cella T adescamento test, la proliferazione cellulare è stato analizzato mediante citometria a flusso dopo co-coltura di cellule dendritiche da entrambi i gruppi di topi con estere carboxyfluorescein succinimidil (CFSE) – etichettato cellule CD4 + T di OTII topi transgenici. Questo approccio ha fornito una determinazione accurata della percentuale di cellule proliferanti CD4 + T con migliorata significativamente sensibilità globale rispetto alla tradizioneal saggi con reagenti radioattivi. Un sistema provetta è stato utilizzato in entrambe le procedure di coltura cellulare e citochine colorazione del protocollo ICS. Rispetto al tradizionale sistema basato piastra di coltura tissutale, questa procedura modificata era più facile per eseguire a livello di biosicurezza (BL) 3 strutture. Inoltre, le cellule infette WNV- sono state trattate con paraformaldeide in entrambi i test, che ha consentito un'ulteriore analisi fuori strutture BL3. Nel complesso, questi in vitro test immunologici possono essere utilizzati per valutare in modo efficace risposta immunitaria cellulo-mediata durante l'infezione da WNV.
Introduction
Virus West Nile (WNV), una neurotropo, plus-rilevati flavivirus, è una minaccia per la salute pubblica emergente. Attualmente, vaccini sono stati approvati per uso umano 1. Un ceppo WNV attenuato, che ha una sostituzione P38G nel non strutturale (NS) di proteine 4B, è noto per indurre non letalità nei topi ma citochine superiore innate e le risposte delle cellule T nei topi wild-type di WNV NY99 ceppo 2. I topi immunizzati con il mutante NS4B-P38G stati tutti protetti da una sfida secondario con letale wild-type WNV. Questo suggerisce che il mutante NS4B-P38G ha caratteristiche adatte per un vaccino candidato ideale. I meccanismi con cui il mutante NS4B-P38G induce protezione ad alta immunità adattativa non sono chiaramente ancora capito. Toll-like receptors (TLR), che riconoscono pattern molecolari associati ai patogeni, svolgono un ruolo fondamentale nell'avvio di immunità innata alle infezioni virali. Il percorso di segnalazione nucleo TLR utilizza mieloide risposta differenziazione primaria geNE 88 (MyD88) come scheda primaria 3,4. In un recente studio, la segnalazione MyD88 ha dimostrato di giocare un ruolo importante nello sviluppo delle cellule mediata durante WNV NS4B- P38G infezione nei topi mutanti 5. Le cellule dendritiche (DC) sono una delle più importanti cellule presentanti l'antigene espositrici la capacità unica di avviare le risposte delle cellule T primarie durante l'infezione virale 6,7. Cellule T CD4 + e CD8 + entrambi contribuiscono all'immunità protettiva di lunga durata e sono importanti per la sopravvivenza di accoglienza a seguito di tipo selvaggio WNV infezione 8,9. Due saggi immunologici sono stati usati in questo studio per valutare le funzioni di queste cellule nei topi mutanti infettati NS4B-P38G.
In primo luogo, un dosaggio priming di cellule T in vitro è stato utilizzato per confrontare la capacità presentanti l'antigene di DC di wild-type WNV-infetti e MyD88 – / – mice. Per aumentare la sensibilità del test, ingenuo CD4 <sup> + cellule T sono stati isolati da OTII topi transgenici che esprimono uno specifico Vα2 / Vβ5 TCR per l'ovoalbumina pollo (OVA) peptide 323 – 339. DC di WNV topi infetti sono stati purificati, e co-coltura con carboxyfluorescein succinimidil Pasqua (CFSE ) -labeled cellule CD4 + T in presenza di OVA peptide. Dopo 5 giorni di co-coltura, le cellule sono state raccolte e fissate con paraformaldeide (PFA) e analizzati mediante citometria a flusso. Saggi proliferativa, sono state tradizionalmente effettuata mediante incorporazione di 5-bromo-2'-deossiuridina (BrdU) o triziata deoxyriboside timina (3 HTdr) 10. Tuttavia, questi test sono o radioattivi e / o che necessitano di apparecchiature speciali a livello di biosicurezza (BL) 3 strutture, dove vengono condotti studi WNV. L'analisi citofluorimetrica della proliferazione dei linfociti dimezzando seriale dell'intensità di fluorescenza del colorante vitale CFSE è diventato più comunemente usato in saggi immunologici, come il colorante è più stabilee uniformemente incorporati in cellule, rilevata facilmente mediante citometria di flusso, ed è non radioattivo 11. Il test ha anche la capacità di valutare il numero di divisioni cellulari. Uno dei principali vantaggi di questo test in studi WNV è che la fissazione delle cellule infettate con 1-2% PFA possa inattivare WNV 12, che consentirà l'acquisizione dei campioni con un citometro a flusso in un laboratorio BL2.
Successivamente, una procedura modificata intracellulare di citochine colorazione (ICS) è stato utilizzato per studiare il ruolo di MyD88 segnalazione nella regolazione del WNV specifiche risposte delle cellule T in NS4B-P38G topi mutanti-infettati. In questo saggio, splenociti isolati da topi infetti sono stati trattati in vitro con WNV peptidi specifici. Brefeldina A inserito mantenere le citochine all'interno della cellula. Dopo 5 ore di incubazione, le cellule sono state raccolte, lavate e colorate per sottogruppi di cellule T. Le cellule sono state poi fissati in PFA, permeabilizzate e colorate per interferone (IFN) -γ e analizzate mediante citometria a flusso.Come con altri flusso-citometria saggio basato, una volta che le cellule vengono trattate con fissazione e tampone di permeabilizzazione contenente PFA, campioni infetti possono essere trasferiti ad un laboratorio BL2 per l'ulteriore elaborazione e analisi. In diversi studi pubblicati, abbiamo usato ICS per misurare le funzioni effettrici delle cellule T in WNV-infetti topi 13,14. Anche se è ben consolidata, uno svantaggio principale di questo saggio è che la procedura è molto lunga e potrebbe essere più tempo quando eseguita all'interno di strutture BL3. Qui, un metodo basato ICS-tube micro-centrifuga ha dimostrato di essere più fattibile, facile procedere e richiede meno tempo quando eseguita all'interno di un laboratorio BL3.
Protocol
Representative Results
Discussion
WNV è un patogeno BL3. A causa delle norme di sicurezza, test immunologici con i campioni WNV-infetti sono spesso limitati dalla disponibilità di attrezzature in BL3 strutture o più lungo e noioso per eseguire. In un recente studio, abbiamo utilizzato due metodi basati citometria a flusso per studiare cellule risposte immunitarie mediate durante l'infezione WNV 5. In entrambi i test, le cellule infettate da WNV sono stati trattati con 1-2% direttamente o con una soluzione di fissaggio / permeabilizzazi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grants to T.W. (R01AI072060 and R01AI099123). G. Xie was supported by a Sealy Center for Vaccine Development Predoctoral Fellowship. We thank Dr. Richard Flavell (Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven) and Dr. Shizuo Akira (Osaka University, Japan) for providing the MyD88–/– mice and Dr. Y Cong (UTMB, Galveston) for providing OTII transgenic mice.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | warm up at 37C |
| anti-CD11c magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | follow the manufacturer’s instructions |
| anti-CD4 magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-095-248 | follow the manufacturer’s instructions |
| CFSE | Invitrogen | C34554 | |
| OVA residue 323-339 | Genscript Corporation | RP10610 | |
| Peptides | Proimmune | PC0AD-D | |
| Brefeldin A solution | BD Bioscience | 555029 | |
| Mouse Fc Blocker | e-Bioscience | 14-0161-85 | |
| APC-conjugated CD4 | e-Bioscience | 17-0041-81 | |
| FITC-conjugated CD8 | e- bioscience | 11-0081-82 | |
| Fixation/Permeabilization Solution | BD- Bioscience | 554722 | |
| Permeabilization/wash buffer | BD- Bioscience | 554723 | |
| anti-IFNg-PE | e-Bioscience | 12-7311-82 | |
| Accuri flow cytometer | BD Bioscience |
Riferimenti
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