As cinesinas são caracterizados pela interacção dependente de nucleótido com microtúbulos: um ciclo de facturação ATP acoplado a um ciclo de interacção dos microtúbulos. Aqui, nós descrevemos protocolos para analisar a cinética da transição de nucleótidos individuais do ciclo de facturação de uma quinesina ATP utilizando nucleótidos marcados com fluorescência e fluorescência de fluxo parado.
A superfamília de cinesina das proteínas de motor de microtúbulos associados compartilhar um domínio motor característica que ambas hidrolisa ATP e liga-se os microtúbulos. Kinesins mostrar as diferenças entre a superfamília, tanto em volume de negócios ATP e na interação dos microtúbulos. Estas diferenças adaptar kinesins específicos para diversas funções, tais como transporte de carga, microtúbulos deslizante, microtúbulos despolimerização e estabilização dos microtúbulos. Para compreender o mecanismo de acção de uma quinesina é importante para compreender a forma como o volume de ciclo de química ATP está acoplado ao ciclo de interacção mecânica microtúbulos. Para dissecar o ciclo de facturação de ATP, uma abordagem consiste em utilizar os nucleótidos marcados com fluorescência para visualizar os passos individuais do ciclo. A determinação da cinética da transição de cada nucleótido no ciclo de facturação ATP permite que o passo limitante da velocidade ou passos para o ciclo completo para ser identificado. Para uma cinesina, é importante conhecer o passo limitante da taxa, ema ausência de microtúbulos, como este passo é geralmente acelerada vários milhares de vezes quando a cinesina interage com microtúbulos. O ciclo na ausência de microtúbulos é então comparado com o na presença de microtúbulos de compreender completamente ATP ciclo de facturação de uma cinesina. A cinética da transição de nucleótidos individuais são geralmente demasiado rápida para observar misturando manualmente os reagentes, particularmente na presença de microtúbulos. Um dispositivo de mistura rápida, tal como um fluorímetro de fluxo parado, o que permite que a cinética de ser observada em escalas de tempo de tão pouco como alguns milésimos de segundo, pode ser utilizado para monitorar tais transições. Aqui, nós descrevemos os protocolos em que a mistura rápida dos reagentes de stopped-flow é utilizado em conjunção com nucleótidos marcados com fluorescência para dissecar o ciclo de facturação de um ATP cinesina.
As cinesinas são uma superfamília de proteínas caracterizada por um domínio altamente conservado do motor 1. O domínio motora cinesina interage com microtúbulos de um modo dependente-nucleótido. Os membros da família kinesin exibir uma gama de funções de kinesins translocação, que transportam cargas de uma forma direcionada ao longo dos microtúbulos, a kinesins de ligação finais não translocação de microtúbulos, que regulam a dinâmica dos microtúbulos 2,3.
Kinesins utilizar o volume de negócios de adensosine-5'-trifosfato (ATP) para regular a sua interação com o citoesqueleto de microtúbulos 4-6. A conformação do domínio motora cinesina e, por conseguinte, a sua afinidade para a microtúbulos depende do seu estado de nucleótidos: de ATP, ADP, ADP.Pi ou não de nucleótidos podem ser ligados (Figura 1). Para compreender o mecanismo molecular de uma quinesina, é necessária uma compreensão da relação entre o volume de ATP e interacção dos microtúbulos. Aguinte, um importante objectivo no campo da cinesina é para caracterizar as propriedades funcionais de diferentes estados de nucleótidos e a cinética das transições entre ambos na presença e na ausência de microtúbulos.
Figura 1 O ciclo de facturação mais simples do ATP para uma cinesina consiste em quatro estados possíveis: (Φ) livre de nucleótido, o ATP-ligado, ADP.P i -bound e ADP-bound Cada um dos quatro transições é caracterizada por um para a frente e. taxa constante para trás (k x k-x e, respectivamente).
Para compreender como a química do ciclo de facturação ATP está acoplado ao ciclo de interacção mecânica microtúbulos, deve-se determinar qual o passo do ciclo de facturação ATP é limitante da taxa na ausência de microtubules e, em seguida, determinar a forma como o ciclo é alterado pela presença de microtúbulos. O ciclo de facturação simples ATP consiste em quatro passos químicos individuais: (1) ligação de ATP para o local vazio (Φ indica o local vazio, ou seja, livre de cinesina-nucleótido); (2) clivagem do ATP; (3) fosfato de dissociação e (4) dissociação ADP (Figura 1). O passo limitante de velocidade define a constante de velocidade para o ciclo completo volume de ATP. Portanto, para determinar qual é o passo limitante da velocidade de cada uma das transições individuais deve ser medido e comparado com a constante de velocidade para o ciclo completo. Os métodos para medir a constante de taxa de ciclo global rotatividade ATP não são descritos aqui, mas pode ser encontrado na referência 7 Descrevem-se métodos em que as constantes de velocidade para os passos químicos individuais podem ser determinados. Há um número de métodos disponíveis para estudar transições individuais do ciclo de facturação de uma proteína de nucleótidos de hidrólise. Os métodos aqui apresentados têm advantage das propriedades dos nucleótidos marcados com fluoróforo do methylanthraniloyl, geralmente referido como mant, que exibem uma alteração na intensidade de fluorescência após a ligação à proteína 8. O grupo mant é usado porque o seu pequeno tamanho significa que, quando acoplado à ribose (figura 2A), que, geralmente, tem pouco ou nenhum efeito sobre a cinética de ligação de nucleótidos ou hidrólise 9-12. Aqui, nós apresentamos os protocolos que descrevem a utilização de nucleótidos marcados com mant, em conjunto com a fluorescência de fluxo parado, para permitir a observação da ligação e dissociação de nucleótidos no ciclo de facturação de um ATP cinesina.
Aqui, apresentamos os protocolos de observação e análise da cinética de transições entre os estados de nucleotídeos para um kinesin. Estes protocolos utilizam o método de mistura stopped-flow rápido em conjunto com nucleótidos marcados com fluorescência. Métodos deste tipo têm sido amplamente utilizados para o estudo de ligação de nucleótidos e de dissociação para uma variedade de cinesinas 9-11,13-16. Os métodos descritos não permitem a observação de libertação de fosfato (Figura 1, Passo 3). No entanto, a fluorescência de fluxo interrompido pode ser usada para observar a esta transição, utilizando uma proteína de detecção de fosfato para a produção de pares de fosfato para uma mudança de intensidade de fluorescência 17. Os métodos apresentados uso nucleótidos marcados com o pequeno methylanthraniloyl fluoróforo (mant), que geralmente apresentam um aumento na intensidade de fluorescência quando ligados à proteína. Além disso, o fluoróforo mant, quando conjugado com ou em 2 'ou 3' em posição o ribose, muitas vezes, tem pouco ou nenhum efeito sobre a ligação, a dissociação ou a hidrólise do nucleótido 9-12. Mant-nucleótidos marcados estão prontamente disponíveis a partir de fontes comerciais (ver lista de materiais) e são fornecidos como uma mistura dos 2 'e 3' do conjugado uma vez que rapidamente se equilibram novamente, quando purificado com um único isómero 8. Nucleótidos marcados com Mant fazer moléculas repórter excelentes pelo que a cinética de ligação e de dissociação de nucleótidos podem ser observadas.
A utilização de nucleótidos marcados com fluorescência significa que a leitura dos ensaios descritos é uma mudança no tempo real da intensidade de fluorescência. Isto faz com que estes ensaios ideal para a fluorescência de fluxo parado, o que permite uma mistura rápida dos reagentes e da observação de alterações de fluorescência associada com a reacção subsequente em tempo real. A combinação de de fluxo parado como a técnica de mistura e de fluorescência como o método de detecção produz um sistema que é relativamente amostra efficiente. Por exemplo, para adquirir os dados apresentados na Figura 3C requer 0,8-1,0 mg de cinesina-13 purificada, MCAK, e para adquirir os dados apresentados na Figura 4B requer ~ 0,3 mg de cinesina-13 purificada, MCAK. Uma desvantagem do uso de mant como um fluoróforo é que é propenso a fotobranqueamento. Isto pode ser observado no isolamento de cinesina cinética de reacção por mistura de uma solução de nucleótido marcado com mant com tampão de reacção, na ausência de cinesina, no de fluxo parado. A lenta redução na intensidade de fluorescência é observado como o grupo mant torna branqueada. Ao longo da gama de escalas de tempo utilizados nos protocolos descritos fotobranqueamento do grupo mant está bem descrita por uma função linear. Portanto, uma forma simples de corrigir os dados de fotobranqueamento é para se ajustar a uma função exponencial com uma linha de base descrita por uma função linear (isto é, mt + c), em vez da linha de base plana mais comum, descrito por um único parâmetro.
<p class = "jove_content"> ligação mantATPAo medir as constantes de velocidade de associação e de dissociação da mantATP (Secção 2) o ADP, o qual permanece associado com o sítio de ligação de nucleotídeo cinesina na ausência de microtúbulos, devem ser removidos. Esta associação permite mantATP e de dissociação (figura 1, passo 1) para ser observado no isolamento a partir de dissociação ADP. Para conseguir isto, a cinesina é incubado com pelo menos um excesso de 50 vezes de EDTA sobre os locais de ligação de nucleótidos (Passo 2.1). O EDTA sequestra iões Mg 2 + Mg 2 + causando a dissociar-se do bolso de ligação ao nucleótido, o que resulta na libertação do nucleótido 11. Portanto, ao realizar as etapas de 2,1-2,3, é fundamental a utilização de um tampão livre de Mg 2 +. A proteína isenta de cinesina nucleótido é trocada de tampão para separá-lo tanto do nucleótido livre e de EDTA. Para realizar essa separação, uma descartável ge de fluxo por gravidadecoluna l filtração é suficiente e é simples e rápido de usar (ver lista de materiais). A interacção de mantATP com quinesina de nucleótidos livres é realizada a uma gama de concentrações mantATP (Passo 2.4) para permitir desconvolução das constantes de associação e de dissociação da taxa (Passo 2.8). A teoria por detrás experiências deste tipo é bem descrito na referência 18 Na realização destas experiências uma começa com a concentração mais baixa de mantATP. Isso elimina a necessidade de etapas de lavagem entre diferentes concentrações. Provavelmente será necessário para ajustar a sensibilidade do fluorímetro de fluxo parado como a concentração mantATP é aumentada. A concentração mantATP devem estar sempre em excesso pelo menos de 5 vezes em relação à concentração de sítios de ligação de nucleótidos de cinesina para manter as condições de pseudo-primeira ordem. No entanto, como a concentração de mantATP é aumentada, a alteração de sinal pode tornar-se inundado como a fracção de nucleótidos que se liga a cinesina diminui. Therefore, a concentração da cinesina também é aumentado para cada nova concentração de mantATP de tal modo que a concentração de mantATP nunca é maior do que um excesso molar de 10 vezes em relação a locais de ligação de nucleótidos (Passo 2.6).
mantADP dissociação
Apesar da taxa de associação e dissociação para as constantes mantADP pode ser determinada pelo mesmo método descrito para mantATP (Secção 2). A dissociação de ADP a partir de uma quinesina pode ser directamente observada por pré-carregar o local de ligação do nucleótido com mantADP (Passos 3,1-3,3) O complexo mantADP.kinesin é então misturado com um excesso de ATP não marcado (passo 3.5). O excesso não marcado ATP impede a religação da mantADP a cinesina e assim permite que a reacção de dissociação (Figura 1, k 4) para ser observado no isolamento da associação de mantADP. Neste ensaio, a concentração de ATP não marcado deve ser, pelo menos, um excesso molar de 50 vezes de nucleotide sítios de ligação. A teoria por detrás deste ensaio é também descrito na referência 18 Este método directa dá um valor mais preciso para a taxa constante de dissociação do que a extrapolação para o eixo y descrito no Passo 2.8.
Inclusão de microtúbulos
Os métodos descritos podem também ser utilizados para determinar a cinética de ligação e de dissociação de nucleótidos na presença de microtúbulos. Os microtúbulos são introduzidos para as sequências de nucleótidos contendo uma seringa antes da mistura no fluxo parou: a seringa inferior na Figura 3B e 4B (Inserções). Nesta configuração, a cinesina irá satisfazer o nucleótido ao mesmo tempo que satisfaz os microtúbulos. Microtúbulos estabilizados são utilizados, em que o período de vida do polímero tubulina é alargado através da utilização de uma substância química ou de estabilização, tal como o taxol ou um análogo de GTP nonhydrolysable, tais como a guanosina-5 '- [(α, β) -methyleno] trifosfato (GMPCPP, veja a lista de materiais). É possível utilizar dois ciclos de polimerização da tubulina com GMPCPP fazer microtúbulos que podem ser armazenados durante vários meses em 9,19 de azoto líquido. O uso de microtúbulos pré-preparados reduz significativamente as dificuldades práticas para a realização do ensaio. Para incluir microtúbulos nos ensaios, é importante o uso de um tampão de reacção adequado para a estabilidade dos microtúbulos. O tampão de escolha é baseado TUBOS, com o tampão mais comumente usado contendo 80 mM de PIPES pH 6,9, 1 mM de MgCl2 e 1 mM de EGTA (conhecido como BRB80) 20,21.
Os métodos descritos não se restringem a utilização com cinesinas, mas pode ser adaptada e aplicada a qualquer proteína de ligação de nucleótido. Por exemplo, métodos semelhantes têm sido aplicadas para o ciclo de facturação ATP de membros da família de miosina de motores moleculares 12,22 e a utilização de nucleótidos marcados mant guanosina estende-se aindamétodos deste tipo a GTP hidrolisar proteínas 23,24.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho é apoiado pelo Conselho de Pesquisa de Ciências Biológicas Biotecnologia e (BBSRC), a Royal Society e da Universidade de Nottingham.
Name of Material/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments/Description |
2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’triphosphate | Jena Biosciences | # NU-202 | mantATP |
2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’-diphosphate | Jena Biosciences | # NU-201 | mantADP |
Mg-ATP | Roche | # 10519979001 | The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100 mM in 100 mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260 nm (e = 15400 M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20 oC. |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120-500 | 0.5 M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled. |
Dithiothreitol (DTT) | Melford | MB1015 | 1 M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin. |
NAP-5 column | GE Healthcare | # 17-0853 | G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column |
GMPCPP | Jena Biosciences | # NU-405 | nonhydrolysable analogue of GTP |
Stopped-flow fluorimeter | Applied Photophysics | SX20 | A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1 - 100 s to be monitored. |