ロボットマイクロコンタクト印刷（R-μCP）とシーケンシャル求核置換を使用して複雑な培養基材を製造
Summary
Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.
Abstract
In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (μCP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual μCP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-μCP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal ‘click’ chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.
Introduction
同時に非ファウリング本来の特性を維持しながら、共有結合した生化学的リガンドを表示するために、PEGグラフト化表面の能力は、それらの培養基材1,2,3上のエンジニアリング·カスタムマイクロスケール環境のための理想的な選択肢となっています。リガンドコンジュゲートしたPEGブラシにより媒介される生物特異的相互作用は、個々の細胞の表現型上の生体内組織の微小環境において 、複雑な内に見られる生化学的手がかりの効果の還元主義分析を可能にします。さらに、バイオ直交性の「クリック」化学は、それらが天然のコンフォメーション4-6に示されているように、リガンドの方向性固定化を容易にすることができる。このように、PEGのマイクロスケールの空間パターニングは、固定化された生化学的手がかり6,7により誘導される細胞のシグナル伝達を研究するためにインビトロニッチでデザイナーを作成するための汎用性の高いツールですブラシ。
生化学立方の空間パターンを生成するための一般的な方法ESは、PEG共役アルカンチオールのパターンを有するマイクロコンタクト·プリンティング（μCP）金でコーティングされた基材を必要とする。その後、PEG化アルカンチオールの自己組織化単分子膜（SAM）マイクロパターンは、生化学分子の物理吸着を制限例えば、タンパク質、基板のみ8,9の非パターン化領域への。しかし、この技術によって生成されたSAMは、長期細胞培養培地中で酸化に敏感である。したがって、SAMは、アルカンチオールμCP'dは、しばしば他の部位の非ファウリングの安定性10を増加させるために表面開始原子移動ラジカル重合（SI-ATRP）を用いて、PEGポリマーブラシをグラフトされる。具体的には、アルカンチオール重合開始剤のμCP、ω-meraptoundecylブロモイソブチレート、ポリSI-ATRP続いて金被覆表面上のポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート（PEGMEMA）モノマー、長期のマイクロパターン安定性、非有する表面を生成するPEGブラシを汚れ。さらに、これらのさらに、多様な化学的部分11を提示するように改変されることが可能である。
この性質を利用して、沙ら。ら 。直交「クリック」化学を提示する多成分PEGMEMAブラシで培養基板を設計する方法を開発した。この方法では、それらは、複数の固定化リガンド6のマイクロパターンを提示する培養基材を作成するために、順次、アジ化ナトリウム、エタノールアミン、プロパルギルアミンと求核置換を散在μCP/ SI-ATRPの一連のステップを使用。新規な培養基質を設計する手動μCPと一緒にそのような化学物質を使用する可能性は計り知れないが、これは、複数のμCPステップが単一の基板上に整列することが可能な精度と正確さによって制限される。精度と高精度、再現これらの多用途の技術を用いてインビトロニッチ複合体を製造するために必要とされるであろう。
この制限に対処するためにe_content ">は、いくつかの自動化および半自動μCPシステムが生成されている。チャクラらカスタムスタンプはレールシステム上に配置し、使用して金被覆したスライドと等角接触させるμCPシステムを開発コンピュータ制御の空気圧アクチュエータが、この方法は、カスタムスタンプ設計の正確な製造を必要とし、複数のμCP12ステップの実行時 に達成精度のnoレポートを10μmの精度を報告している。最近では、統合されたキネマティックカップリングシステムを利用する方法単一のパターンを使用して、1μm未満の精度を報告したが、正確に13を成形するための金型からのスタンプの特徴の正確な制御の欠如に起因する複数のパターンを位置合わせすることができなかった。また、従来の方法の両方は、基板は、パターン形成工程の間に固定されたままにする必要が、大幅であることができる表面改質の化学的性質の多様性を制限する利用した。切手のデザインと製造における最大の柔軟性を可能にしながらここでは、複数のμCPステップの正確かつ精密な位置合わせが可能な自動化されたR-μCPシステムについて説明します。さらに、パターニングされた基板を繰り返し、それによって連続的な求核置換を含む、多様な基質修飾化学薬品の使用を可能にする、プレス加工の間にシステムから除去することができる。基板は、化学反応を用いて操作達6,14等7の両方によって以前に細胞培養のために使用されている。したがって、我々は、複雑でマイクロパターン生化学的手がかりと培養基質の製造のためのスケーラブルな方法を開発するR-μCP逐次求核置換反応をマージした。Protocol
Representative Results
Discussion
組織工学のための理想的な基質は、バイオインスパイアードし、それにより、ネイティブの組織内で発見の重要な生理活性リガンドの空間分布を再現することになる。彼らはまた、リガンドの時間的な調整およびそれらが向け組織形態形成および細胞運命の空間的に制限された誘導を可能にするために提示される空間パターンを可能にする動的な特性を有するであろう。このような基板の製?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding for this work, GTK, TK, and JDM were provided by the Wisconsin Institute for Discovery and the Wisconsin Alumni Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SCARA | Epson | LS3-401ST | Higher end models with increased precision are available if desired. |
| (TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL)TRICHLOROSILANE | Gelest | SIT8174.0 | CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated. |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesive Co | NC9020938 | Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable. |
| 24mm X 50 mm #1 Cover Glass Slides | Fisher Scientific | 48393106 | These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need. |
| CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator | Telemark | SEC-600-RAP | Requries specialized training. |
| EPSON LS3 SCARA | EPSON | LS3-401ST | |
| ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate | Prochimia | FT 015-m11-0.2 | Store at -20°C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities. |
| Schlenk Tube Flask 50 mL | Synthware | 60003-078 | Requires rubber stoppers with diaphram. |
| Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate | Sigma Aldrich | 447943 | Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors. |
| Methanol (Certified ACS) | Fisher Scientific | A412-4 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Copper(II) Bromide | Sigma Aldrich | 437867 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| 2',2-Bipyridine | Sigma Aldrich | D216305 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | |
| 20mL Borosilicate Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-340-4E | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| N,N-dimethyformamide | Sigma Aldrich | 227056 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | 398136 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Propargylamine | Sigma Aldrich | P50900 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| 200 Proof Ethanol | University of Wisconsin Material Distribution Services | 2292 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Azide-PEG3-Biotin | ClickChemistryTools | AZ104-100 | Solubilized in DMF |
| Copper(II) Sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Sigma Aldrich | 678937 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A7506 | |
| Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 14190144 | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose. |
| 12-Well Polystyrene Plate | Thermo Scientifit – NUNC | 07-200-81 | Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions. |
| DBCO-PEG4-Biotin | Clickchemistytools | A105P4-10 | Solubilized in DMF |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Life Technologies | S-11223 | Solubilized in PBS |
| Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | S-11225 | Solubilized in PBS |
| Nikon A1-R Confocal Microscope | Nikon | Nikon Eclipse Ti, A1R | An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates. |
Riferimenti
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