Fabricating Komplexa Kultur Substrat Använda Robotic Micro Printing (R-μCP) och sekventiell nukleofil substitution

Summary

Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.

Abstract

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (μCP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual μCP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-μCP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal ‘click’ chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.

Introduction

Förmågan hos PEG-ympade ytor för att visa kovalent bundna biokemiska ligander samtidigt bibehålla inneboende icke-fouling egenskaper gör dem till ett idealiskt val för ingenjörs anpassade mikroskala miljöer på odlingssubstrat ^1,2,3. De biospecifika interaktioner medierade av ligand konjugerad PEG borstar möjliggör reduktionistisk analys av effekterna av biokemiska signaler som finns inom komplex in vivo vävnadsmikromiljöer på enskilda cellfenotyper. Vidare kan bio-ortogonala "klick" kemi användas för att underlätta riktad immobilisering av ligander så att de presenteras i nativa konforma ^4-6. Således mikroskala rumsliga mönstring av PEG borstar är ett mångsidigt verktyg för att skapa designer in vitro nischer för att undersöka cellsignalering inducerad av immobiliserade biokemiska signaler ^6,7.

En vanlig metod för att generera rumsliga mönster för biokemisk cues innebär micro utskrift (μCP) guldbelagda substrat med mönster av PEG konjugerade alkantioler. Sedan de micropatterned själv monterade monolager (SAMS) av PEG-ylated alkantioler begränsar fysisk adsorption av biokemiska molekyler, t.ex., proteiner, endast för icke-mönstrade regioner av substratet ^8,9. Emellertid SAMS genereras av denna teknik är känsliga för oxidation i långtidscellkulturmedia. Således är μCP'd alkantiol SAMs ofta vidare ympade med PEG polymerborstar använder ytan initierad atomöverföring radikalpolymerisation (SI-ATRP) för att öka regionens icke-fouling stabilitet ^10. Specifikt μCP av alkantiolen polymerisationsinitiator, ω-meraptoundecyl bromisobutyrat, på guldbelagda ytor följt av SI-ATRP av poly (etylenglykol) metyleter-metakrylat (PEGMEMA) monomerer genererar ytor med micropatterned långvarig, stabil, och icke- påväxt PEG borstar. Dessutom är dessa är i stånd att modifieras ytterligare för att presentera skiftande kemiska delar ^11.

Med utnyttjande av fastigheten, Sha et. al. utvecklat en metod att konstruera odlingssubstrat med fler PEGMEMA borstar som utgör ortogonala "klick" kemi. I denna metod använder de en rad μCP / SI-ATRP steg varvat med sekventiell natriumazid, etanolamin, och propargylamin nukleofila substitutioner för att skapa odlingssubstrat som uppvisar mikroskala mönster av multipla immobiliserade ligander ^6. Även möjligheterna att använda sådana kemiska sammansättningar i kombination med manuell μCP att konstruera nya odlingssubstrat är enorm, det är begränsad av den precision och noggrannhet med vilken flera μCP steg kan anpassas på ett enda substrat. En hög grad av precision och noggrannhet skulle krävas för att reproducerbart tillverka komplexa in vitro nischer som använder dessa mångsidiga tekniker.

e_content "> För att hantera denna begränsning har flera automatiska och halvautomatiska μCP system genererats. Chakra et. al. utvecklat ett μCP system där egna stämplar placeras på ett skensystem och bringas i anpassad kontakt med guldbelagda bilder med hjälp en datorstyrd pneumatiskt manöverdon. Detta kräver dock att metoden exakt tillverkning av egna frimärksmotiv och redovisar ett 10 mikrometer precision med ingen rapport av noggrannheten uppnås vid utförande av flera μCP steg ^12. På senare tid har en metod som utnyttjar ett integrerat kinematiska kopplingssystem rapporterade precision under 1 um med hjälp av ett enda mönster, men kunde inte exakt rikta flera mönster på grund av brist på noggrann kontroll av stämpel funktioner från mögel att forma ^13. Dessutom har båda de tidigare metoderna kräver att substratet förblir fast mellan mönstring steg , vilket avsevärt begränsar mångfalden av ytan modifieringskemi som kan varautnyttjas. Här beskriver vi en automatiserad R-μCP system som kan noggrann och exakt inriktning av flera μCP steg samtidigt maximal flexibilitet i stämpel design och tillverkning. Dessutom kan de mönstrade substrat upprepade gånger bort från systemet mellan stans, vilket möjliggör användning av olika substratmodifieringskemi, inklusive sekventiella nukleofila substitutioner. Substrat konstruerade med hjälp av sådana verksamma ämnen har använts för cellodling tidigare av både oss ^6,14 och övriga ^7. Därför har vi slagit samman R-μCP och sekventiella nukleofila substitutionsreaktioner att utveckla en metod för skalbar framställning av odlingssubstrat med komplexa och micropatterned biokemiska signaler.

Protocol

1. Generera Elastomera Stämplar För att generera PDMS stämpel är kisel mästare, utforma fotomask s funktionsmönster med hjälp av datorstödd design mjukvara. Designa det första mönstret som en 20 x 20 matris med ringarna med 300 um innerdiameter (ID) och 600 pm OD med 1.200 um centrum till centrumavstånd. Utforma andra mönster som en 20 x 20 matris med ringarna med 600 pm-ID och 900 um OD med 1.200 um centrum till centrumavstånd. Dessutom, pl…

Representative Results

Användningen av manuell inriktning μCP tekniker för att modifiera odlingssubstrat med arrayer av PEG-ympade borstar funktionaliserade med ortogonal "klick" kemier har visats i tidigare arbete 6. Emellertid erbjuder detta minimal kontroll av mönsterorientering och ofta resulterar i överlappning av funktionaliserade områden. Här används en ny R-μCP system som används för att övervinna denna begränsning, och dess förmåga att korrekt mönster en matris av PEG borste ringarna med 300 | j, …

Discussion

Perfekt substrat för tissue engineering skulle Bioinspired och därmed sammanfatta den rumsliga fördelningen av kritiska bioaktiva ligander som finns inom de naturliga vävnader. De skulle också ha dynamiska egenskaper som gör att tids justeringar av ligander och de rumsliga mönster som de presenteras för att möjliggöra riktade vävnadsmorfogenes och rumsligt begränsade induktion av cell öde. Tillverkning av sådana substrat kräver immobilisering av flera biokemiska signaler i komplexa och mycket beställda r…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SCARA	Epson	LS3-401ST	Higher end models with increased precision are available if desired.
(TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL)TRICHLOROSILANE	Gelest	SIT8174.0	CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesive Co	NC9020938	Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable.
24mm X 50 mm #1 Cover Glass Slides	Fisher Scientific	48393106	These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need.
CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator	Telemark	SEC-600-RAP	Requries specialized training.
EPSON LS3 SCARA	EPSON	LS3-401ST
ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate	Prochimia	FT 015-m11-0.2	Store at -20°C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities.
Schlenk Tube Flask 50 mL	Synthware	60003-078	Requires rubber stoppers with diaphram.
Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate	Sigma Aldrich	447943	Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors.
Methanol (Certified ACS)	Fisher Scientific	A412-4	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Copper(II) Bromide	Sigma Aldrich	437867	CAUTION, limit exposure with surgical mask.
2',2-Bipyridine	Sigma Aldrich	D216305	CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Sodium L-Ascorbate	Sigma Aldrich	A4034
20mL Borosilicate Glass Scintillation Vials	Fisher Scientific	03-340-4E
Sodium Azide	Sigma Aldrich	S2002	CAUTION, limit exposure with surgical mask.
N,N-dimethyformamide	Sigma Aldrich	227056	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Ethanolamine	Sigma Aldrich	398136	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Triethylamine	Sigma Aldrich	T0886	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Dimethylsulfoxide	Sigma Aldrich	276855	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Propargylamine	Sigma Aldrich	P50900	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
200 Proof Ethanol	University of Wisconsin Material Distribution Services	2292	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Azide-PEG3-Biotin	ClickChemistryTools	AZ104-100	Solubilized in DMF
Copper(II) Sulfate	Sigma Aldrich	C1297	CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)	Sigma Aldrich	678937
L-Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A7506
Phosphate Buffer Saline	Invitrogen	14190144
Donkey Serum	Sigma Aldrich	D9663	Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose.
12-Well Polystyrene Plate	Thermo Scientifit – NUNC	07-200-81	Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions.
DBCO-PEG4-Biotin	Clickchemistytools	A105P4-10	Solubilized in DMF
Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate	Life Technologies	S-11223	Solubilized in PBS
Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate	Life Technologies	S-11225	Solubilized in PBS
Nikon A1-R Confocal Microscope	Nikon	Nikon Eclipse Ti, A1R	An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates.