Специфика анализа белковых лизина метилтрансферазы Использование SPOT пептидов массивов
Summary
Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.
Abstract
Лизин метилирование новых посттрансляционной модификации и была обнаружена в нескольких гистонов и не белков гистонов, где он играет решающую роль в развитии клеток и многих заболеваний. Примерно 5000 лизина метилирования были определены на различных белков, которые устанавливаются несколько десятков белков лизина метилтрансферазы. Это говорит о том, что каждый PKMT метилирует несколько белков, однако до сих пор только один или два субстраты были определены для нескольких из этих ферментов. Подойти к этой проблеме, мы ввели массив пептид на субстратной специфичности анализа PKMTs. Пептидные массивы являются мощными инструментами для характеристики специфики PKMTs, потому что метилирование некоторых субстратов с различными последовательностями могут быть проверены на одном массиве. Мы синтезировали пептид массивов на целлюлозной мембране с использованием синтезатора Intavis SPOT и проанализировал специфику различных PKMTs. Основываясь на результатах, для некоторых из этих ферментов, роман смогут быть определены ubstrates. Например, для NSD1 с использованием пептидных массивов, мы показали, что метилирует K44 из H4 вместо сообщалось H4K20 и, кроме того H1.5K168 является наиболее предпочтительным субстратом по ранее известной H3K36. Таким образом, пептидные массивы являются мощными инструментами биохимически характеризующие PKMTs.
Introduction
В течение последних двух десятилетий, в нескольких докладах продемонстрировали важность пост-трансляционных модификаций (PTM) в сотовой развития и ряда заболеваний, таких как рак, но в последнее белок лизин метилирование появился как еще один важный ПТМ. В то время как изначально гистона метилирование лизина было установлено, что существенную хроматина знак, а затем работы также показали, лизин метилирование нескольких негистоновых белков 1-4. Последовательное перемещение метильных групп от S-аденозил-L-метионина в ε-аминогруппой остатков лизина катализируется семейством ферментов, называемых белка лизина метилтрансферазы (PKMTs), который содержит более 60 белков в геноме человека. PKMTs были первоначально обнаружен как гистонов модификации ферментов, которые метилировать конкретный остаток лизина, но более поздние сообщения продемонстрировали, что они могут также метилировать негистоновые белки 5. До сих пор, около 5000 лизина метилирования сайты были определены на разных белков 6 </sвверх>, но ферменты, ответственные за эти изменения часто не определены. Одна из причин этого является то, что специфика большинства PKMTs не изучена. Таким образом, периодически происходит то, что новые субстраты PKMTs обнаружены. Отсутствие детального знания субстратной специфичности PKMTs препятствует пониманию их биологической функции и роли. Для изучения специфичности в PKMT подробно, скорости метилирования многих пептидных субстратов, которые отличаются в одной или нескольких аминокислот должны быть измерены и по сравнению, которые идеально сделано с помощью пептидных массивов. На основании полученных профилей специфичности, потенциальные субстраты PKMTs могут быть идентифицированы, которые могут быть изучены дополнительно.
Пептидные массивы широко используются средства для биохимического анализа антител, пептидов, модифицирующих ферментов и отображения сайтов белок-белкового взаимодействия (антитело-антиген, рецептор-лиганд) 7-9. Несколько сотен пептидов, необходимых для Sucч приложений. Различные способы доступны для пептидного синтеза, среди которых пептидный синтез на смоле очень широко используется, но имеет ограничения в пропускной способности, и это относительно дорого. Эти вопросы были решены с введением метода синтеза SPOT Франка и его коллеги 10. Способ синтеза точке позволяет синтез нескольких сотен пептидов параллельно и в среднем это недорого по сравнению с синтезом смолы. Пептиды, синтезированные на целлюлозной мембране могут быть использованы либо непосредственно для различных применений или пептидов могут быть расщеплены из мембраны и используют в качестве свободных пептидов в растворе для анализов или приготовить пептид микрочипов 10-13.
Синтез пятно вариант твердофазного пептидного синтеза, который использует в качестве целлюлозы мембраны с твердым носителем, и использует стандартный Fmoc-химии 10-13. Следовательно, синтез пептидных цепей начинается в конце C-концевой и переходит кконец N-терминал в отличие от биологического синтеза в рибосомах. Целлюлозные мембраны функционализированные для крепления первого активированного аминокислот (рис. 1). Способ пятно на основе последовательного доставки активированных аминокислот в капле растворителя для определенных точек на мембране с использованием автоматизированной системы пипетирования. Капелек жидкости распределяется на пористой мембране, где он образует круглое мокрое пятно, которое затем действует в качестве открытого реактора для химических реакций в синтезе пептидов. Размер пятна определяется объем разливаемого и поглотительной способности мембраны, кратные таких местах расположены как массивы. Шкала синтеза коррелирует с размером пятна и грузоподъемностью мембраны. Расстояние между пятнами и плотности массивов управляются путем изменения размеров пятна. Целлюлоза мембрана имеет несколько преимуществ, как твердой фазы в синтезе пептидов, недорого, толерантных к химикоALS, используемые в синтезе пептидов, стабильные в водных растворах и прост в обращении. Кроме того, его гидрофильность делает его пригодным для нескольких биологических тест-системах. Синтез пятно может осуществляться вручную или автоматически (по 1000s пептидов) в зависимости от требуемого количества пептидов. Полностью автоматизированный синтезатор SPOT из Intavis (Köln, Германия) используется для наших приложений. Это позволяет синтезировать пептиды в различных количествах и разной длины. Линейные пептиды регулярно синтезировали с длиной от 15 до 20 аминокислот, в дополнение пептидов до 42 аминокислот могут быть также получены путем ступенчатого синтеза 14,15. Тем не менее, увеличение числа аминокислот приводит к снижению общих выходов связи, что влияет на качество пептидов. Из-за малого количества пептидов в месте, продукты зачастую трудно очистить и качество индивидуальных пептидов не может быть легко оценена. Таким образом, результаты, полученные с места PeptIDE массивы должны быть подтверждены либо пептидов, синтезированных с помощью стандартных методов в более широком масштабе, которые могут быть очищены и проанализированы в соответствии со стандартами в пептидного синтеза или путем синтеза белков, содержащих желаемые последовательности пептида. Тем не менее, мы обнаружили, что синтез место, чтобы быть очень надежным и результаты, как правило, чтобы быть воспроизводимым. Синтез пятно не ограничивается протеиногенных аминокислоты, несколько коммерчески доступных модифицированные аминокислоты также могут быть использованы для синтеза, что позволяет пептиды, которые будут изменены до и после окончательного расщепления защитной группы боковой цепи и, кроме того, она также позволяет включение Фосфорилированные, метилированных или ацетилированного аминокислоты 11.
Иммобилизованные пептидных библиотек, синтезированные по методу SPOT могут быть непосредственно использованы для многих биологических и биохимических анализов. Мы использовали пептидные массивы, содержащие 300-400 пептиды исследовать субстратной специфичности PKMTs. Для ферментативного modifiКатион, массивы пептидные инкубируют с соответствующим PKMT и помечены [метил- 3 H] -AdoMet в соответствующем буфере. Метилирование соответствующего субстрата анализировали с помощью следующих ферментативной передачу радиоактивно меченных метильных групп от AdoMet к пептидного субстрата с помощью авторадиографии (рис. 3). В результате этой процедуры, массивы пептидные позволить изучение метилирования различных пептидных субстратов, в то же время. Одним из важных преимуществ этого метода является то, что все пептиды метилированный в конкуренции, таким образом, что при линейной фазы метилирования кинетики, относительная метилирование каждого пептида пропорциональна каталитической константы скорости, деленное на константу диссоциации (K / K кошки D) фермента для соответствующего пептидного субстрата. Таким образом, количество радиоактивности включены в каждом месте непосредственно коррелирует с ферментативной активностью по отношению к конкретной пептида. ИспользованиеРезультаты метилирования эксперимента пептид массива, специфика профиль PKMT могут быть определены и на основе этого новых подложек могут основываться. Пептидные массивы позволить быстрое и экономически эффективное проверку метилирования новых субстратов на уровне пептидной. Для этого, массивы, которые содержат получают прогнозируемые новые субстраты с модифицированными пептидами, содержащими Ala вместо Lys в целевых объектов, а также положительных и отрицательных контрольных пептидов. Наконец, новые субстраты могут быть получены, как белки совместно с мутантами, в котором целевая Lys изменяется в Ala и метилирование может быть подтверждено на уровне белка. В зависимости от результатов, это затем следуют биологических исследований, касающихся потенциальной роли метилирования вновь описанных белковых субстратов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Синтез SPOT, как описано здесь мощный метод для отображения сайтов белок-белковые взаимодействия и исследовать признание подложки пептидных изменения ферментов. Тем не менее, синтез SPOT-прежнему имеет определенные недостатки, потому что, хотя пептиды, синтезированные по методу SPOT, как со…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
| N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
| Piperidine ≥ 99 % for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥ 98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Triisopropylsilane 99%, | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
| Dichlormethane ≥99,9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
| N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
| Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
| Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
| MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
| HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix software | TotalLab | n.a. |
Riferimenti
- Margueron, R., Reinberg, D. Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information. Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Helin, K., Dhanak, D. Chromatin proteins and modifications as drug targets. Nature. 502, 480-488 (2013).
- Clarke, S. G. Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box. Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).
- Rathert, P., et al. Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets. Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).
- Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation. Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).
- Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology. Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).
- Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions. Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).
- Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays. Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports–principles and applications. Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).
- Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).
- Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).
- Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method. Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).
- Toepert, F., et al. Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).
- Volkmer, R. Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology. Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).
- Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays. Chemistr., & biology. 15, 5-11 (2008).
- Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues. Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).
- Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase. Chemistr., & Biology. 18, 111-120 (2011).
- Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1. Chemistr., & Biology. 21, 226-237 (2014).
- Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs. Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).
- Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method. Chimica. 6, 3196-3203 (2000).
- Kramer, A., et al. Spot synthesis: observations and optimizations. J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).
- Stadler, V., et al. Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).
- Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays. Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).
- Mah, A. S., et al. Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening. BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).
