蛋白赖氨酸甲基转移使用SPOT肽阵列特异性分析
Summary
Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.
Abstract
赖氨酸的甲基化是一个新兴的翻译后修饰，这已被确定在几个组蛋白和非组蛋白，它在细胞发育和许多疾病的关键角色。大约5000赖氨酸甲基化位点被确定在不同的蛋白质，这是由数十个蛋白赖氨酸甲基转移设置。这表明，每PKMT甲基化多种蛋白，但至今只有一个或两个基片已被确定为若干这些酶。 PKMTs来解决这个问题，我们引入肽基于阵列的底物特异性分析。肽阵列功能强大的工具来PKMTs的特异性表征，因为几个底材具有不同序列的甲基化可以在一个阵列进行测试。我们使用Intavis SPOT合成仪合成肽阵列纤维素膜和分析各种PKMTs的特异性。基于该结果，对于几个这些酶的，新的substrates可以被识别。例如，对于NSD1通过采用肽阵列，我们表明，甲基化H4的K44代替报告H4K20并且另外H1.5K168高于先前已知的H3K36高度优选的基材。因此，肽阵列功能强大的工具，生化表征PKMTs。
Introduction
在过去的二十年里，若干报告证实在细胞发育和一些疾病，如癌症，但最近的蛋白赖氨酸的甲基化已成为一个重要的另一个PTM翻译后修饰（PTM）的重要性。而最初组蛋白赖氨酸的甲基化被认为是一个重要的染色质标记，以后的工作中也表现出若干非组蛋白1-4的赖氨酸的甲基化。甲基的从S-腺苷-L-甲硫氨酸的顺序转印到赖氨酸残基的ε氨基用一个家族的酶称为蛋白赖氨酸甲基转移（PKMTs）的包含超过60蛋白在人类基因组催化。 PKMTs最初发现的组蛋白修饰酶的具体甲基化赖氨酸残基，但后来的报告显示，他们也可以非甲基化，组蛋白5。到现在为止，大约5000赖氨酸甲基化位点被确定在不同的蛋白质6 </s向上>，但负责这些修饰的酶经常没有确定。其中一个原因是，大多数PKMTs的特异性尚未得到广泛研究。因此，它循环地发生时PKMTs的新颖底物被发现。的PKMTs的底物特异性的详细知识的缺乏阻碍了它们的生物学功能和作用的理解。详细研究一个PKMT的特异性，即不同的一个或几个氨基酸多肽底物的甲基化率，必须测量和比较，这是理想的完成利用肽阵列。基于所得到的特异性概况，PKMTs的潜在底物可以被识别，可以进一步进行研究。
肽阵列是广泛使用的工具为抗体，肽修饰酶和蛋白质-蛋白质相互作用位点（抗体-抗原，受体-配体）7-9映射的生化分析。都需要SUC几百肽ħ应用。不同的方法可用于肽合成，其中肽在树脂上合成是很常用的，但它有局限性的吞吐量，这是相对昂贵的。这些问题得到解决，推出了弗兰克和他的同事10的SPOT合成方法。现货合成方法合成允许几百肽并行，平均也比树脂合成低廉。合成在纤维素膜上的肽可以使用，也可以直接用于各种应用或肽可以从膜被切割并在溶液测定中使用作为游离肽或以制备肽微阵列10-13。
SPOT合成的固相肽合成，其使用纤维素膜作为固体支持物，并采用标准的Fmoc-化学10-13的变体。因此，肽链的合成开始于C-末端，并进入朝所述N-末端在对比的生物合成的核糖体。纤维素膜官能化的第一个被激活的氨基酸（ 图1）的附件。当场方法是基于使用自动吸移系统的连续输送的活化氨基酸中的溶剂，以在所述膜限定的斑点的液滴。液体的液滴分配在那里形成一个圆形的湿斑，后来作为一个开放的反应器用于在肽合成的化学反应的多孔膜。光斑尺寸由分配的体积，膜的吸收能力确定的，这样的点的倍数被布置为阵列。合成的规模相关的光斑尺寸和隔膜的负载能力。斑点和阵列的密度之间的距离是通过改变该斑点尺寸管理。纤维素膜具有几个优点如在肽合成的固相，它是便宜的，耐受性的CHEMIC在肽合成中使用ALS，稳定在水溶液中，并容易处理。另外，它的亲水性使其适用于多种生物测定系统。 SPOT合成可以手动进行或自动（对于肽1000），这取决于肽的所需数量。从Intavis（科隆，德国）一个完全自动化的SPOT合成器可用于我们的应用程序。它允许合成肽不同长度的不同数量和。线性肽经常与15至20个氨基酸长度的合成，在高达42个氨基酸加成肽也可以通过逐步合成14,15制备。然而，增加的氨基酸的数目导致降低整体耦合的产量，从而影响所述肽的质量。因为每点的肽的低量的，该产品往往难以纯化和个别的肽的质量不能容易地进行评估。因此，结果从SPOT PEPT获得IDE阵列必须确认或者用肽通过标准方法在较大的规模，这可以被纯化，并根据在肽合成或通过合成含有所需的肽序列的蛋白质的标准分析合成。尽管如此，我们发现SPOT合成是高度可靠和一般结果是重复的。 SPOT合成不限于蛋白氨基酸，几种市售修饰的氨基酸也可用于合成，使肽之前和侧链保护基团的最终切割，此外后进行修改，它也允许掺入磷酸化，甲基化或乙酰化氨基酸11。
由斑点方法合成固定化肽文库可直接用于许多生物和生化分析。我们采用包含300-400肽进行调查PKMTs的底物特异性的肽阵列。对于酶modifi阳离子，肽阵列一起温育的各PKMT和标记的[甲基- 3 H] – -AdoMet在适当的缓冲液中。各个基板的甲基化是由以下的放射性标记的甲基的距离的AdoMet通过放射自显影（ 图3）的酶促转移到肽底物进行分析。通过此过程中，肽阵列允许不同的肽底物的甲基化的同时研究。这种方法的一个重要优点是，所有的肽都甲基化的竞争，使得在所述甲基化动力学的线性相位，每种肽的相对甲基化正比于催化速率常数通过解离常数（k 猫 / K除以D中的酶用于各个肽底物）。因此，放射性掺入每个斑点的量直接与朝向特定的肽酶活性。使用的肽阵列甲基实验的结果来看，PKMT的特异性轮廓可以定义和基于这一新基材可为前提。肽阵列允许的新颖底物在肽水平的甲基化的快速和成本有效的验证。对于这一点，阵列是制备包含该预测的新颖底物与含有丙氨酸代替赖氨酸在靶位点修饰的肽以及阳性和阴性对照的肽一起。最后，新的衬底可以被制备为蛋白质连同突变体，其中靶的Lys被改变为丙氨酸和甲基化可以在蛋白质水平证实。根据结果，这随后是生物学研究解决新描述蛋白质底物的甲基化的潜在作用。
Protocol
Representative Results
Discussion
如这里所描述的SPOT合成是一个功能强大的方法来映射蛋白质 – 蛋白质相互作用位点，并调查肽修饰酶的底物识别。然而，SPOT合成仍有某些缺点，因为虽然由点法合成的肽被报道具有90％以上的纯度21这难以确认在每个实例。因此，结果必须通过其他方法，例如使用蛋白质结构域或与通过标准方法合成的纯化的肽被再现。另外，点阵列的另一主要缺点是，大多数时候它们不能被重新使用来?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
| N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
| Piperidine ≥ 99 % for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥ 98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Triisopropylsilane 99%, | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
| Dichlormethane ≥99,9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
| N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
| Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
| Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
| MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
| HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix software | TotalLab | n.a. |
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