स्पॉट पेप्टाइड arrays का उपयोग प्रोटीन लाइसिन Methyltransferases की विशिष्टता विश्लेषण
Summary
Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.
Abstract
लाइसिन मेथिलिकरण एक उभरती के बाद अनुवाद संशोधन है और यह सेल विकास और कई बीमारियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जहां यह कई हिस्टोन और गैर हिस्टोन प्रोटीन पर पहचान की गई है। लगभग 5,000 लाइसिन मेथिलिकरण साइटों प्रोटीन लाइसिन Methyltransferases की कुछ दर्जनों द्वारा स्थापित कर रहे हैं, जो विभिन्न प्रोटीन, पर पहचान की गई। यह अब केवल एक या दो substrates इन एंजाइमों के कई के लिए पहचान की गई है हालांकि, जब तक प्रत्येक PKMT कई प्रोटीन methylates कि पता चलता है। इस समस्या के दृष्टिकोण के लिए, हम शुरू की है पेप्टाइड सरणी आधारित सब्सट्रेट विशिष्टता PKMTs का विश्लेषण करती है। पेप्टाइड सरणियों विभिन्न दृश्यों के साथ कई substrates के मेथिलिकरण एक सरणी पर परीक्षण किया जा सकता है क्योंकि PKMTs की विशिष्टता को चिह्नित करने के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं। हम एक Intavis स्पॉट सिंथेसाइज़र का उपयोग कर सेल्यूलोज झिल्ली पर पेप्टाइड सरणियों संश्लेषित और विभिन्न PKMTs की विशिष्टता का विश्लेषण किया। इन एंजाइमों के कई के लिए, परिणाम के आधार पर, उपन्यास कीubstrates पहचाना जा सकता है। उदाहरण के लिए, पेप्टाइड सरणियों को रोजगार से NSD1 के लिए, हम इसे एच 4 की K44 के बजाय सूचना दी H4K20 methylates और इसके अलावा में H1.5K168 पहले से ज्ञात H3K36 पर अत्यधिक पसंदीदा सब्सट्रेट है कि पता चला है। इसलिए, पेप्टाइड सरणियों को biochemically PKMTs चिह्नित करने के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं।
Introduction
पिछले दो दशकों में, कई रिपोर्टों सेलुलर विकास और कैंसर जैसी कई बीमारियों, लेकिन हाल ही में प्रोटीन लाइसिन मेथिलिकरण एक अन्य महत्वपूर्ण PTM रूप में उभरा है में बाद translational संशोधनों (PTM) के महत्व का प्रदर्शन किया। शुरू में हिस्टोन लाइसिन मेथिलिकरण एक आवश्यक क्रोमेटिन निशान हो पाया था, बाद में काम भी कई गैर हिस्टोन प्रोटीन 1-4 लाइसिन मेथिलिकरण दिखाया। लाइसिन अवशेषों की ε अमीनो समूह के लिए एस-adenosyl एल मेथिओनिन से मिथाइल समूह के अनुक्रमिक हस्तांतरण मानव जीनोम में 60 से अधिक प्रोटीन होता है कि प्रोटीन लाइसिन Methyltransferases (PKMTs) नामक एंजाइम का एक परिवार द्वारा उत्प्रेरित कर रहा है। PKMTs शुरू में विशिष्ट लाइसिन अवशेषों methylate लेकिन बाद में रिपोर्टों वे भी गैर हिस्टोन प्रोटीन 5 methylate सकता है कि प्रदर्शन किया है कि हिस्टोन संशोधित एंजाइमों के रूप में खोज रहे थे। अब तक, लगभग 5,000 लाइसिन मेथिलिकरण साइटों के विभिन्न प्रोटीन 6 पर पहचान की गई </sऊपर>, लेकिन इन संशोधनों के लिए जिम्मेदार एंजाइमों अक्सर पहचान नहीं कर रहे हैं। इसका एक कारण यह सबसे PKMTs की विशिष्टता बड़े पैमाने पर अध्ययन नहीं किया गया है। इसलिए, यह खरीदे PKMTs के उपन्यास substrates के खोज कर रहे हैं कि तब होती है। PKMTs की सब्सट्रेट विशिष्टता का विस्तृत ज्ञान की कमी के कारण उनके जैविक समारोह और भूमिका की समझ hinders। विस्तार में एक PKMT की विशिष्टता का अध्ययन करने के लिए, एक या कुछ अमीनो एसिड में अलग है कि कई पेप्टाइड substrates के मिथाइलेशन दरों मापा जाना चाहिए और आदर्श पेप्टाइड सरणियों का उपयोग किया जाता है, जो की तुलना में। जिसके परिणामस्वरूप विशिष्टता प्रोफाइल के आधार पर, PKMTs के संभावित substrates के आगे अध्ययन किया जा सकता है कि पहचाना जा सकता है।
पेप्टाइड सरणियों व्यापक रूप से एंटीबॉडी, पेप्टाइड संशोधित एंजाइम और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत साइटों (एंटीबॉडी प्रतिजन, रिसेप्टर ligand) 7-9 की मैपिंग के जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए उपकरणों का इस्तेमाल कर रहे हैं। पेप्टाइड्स के कई सैकड़ों सफलता के लिए आवश्यक हैंएच अनुप्रयोगों। अलग अलग तरीकों से उन्हें बहुत अधिक इस्तेमाल किया जाता है राल पर संश्लेषण पेप्टाइड के बीच में, पेप्टाइड संश्लेषण के लिए उपलब्ध हैं, लेकिन यह throughput में सीमाएं हैं और यह अपेक्षाकृत महंगी है। इन मुद्दों फ्रैंक और उनके सहयोगियों ने 10 से स्पॉट संश्लेषण विधि की शुरुआत के साथ सुलझाया गया। स्पॉट संश्लेषण विधि समानांतर में कई सौ पेप्टाइड्स के संश्लेषण की अनुमति देता है और औसत पर यह राल संश्लेषण की तुलना में सस्ती है। सेलूलोज झिल्ली पर संश्लेषित पेप्टाइड्स झिल्ली से cleaved और समाधान assays में लिए मुफ्त पेप्टाइड्स के रूप में इस्तेमाल किया है या पेप्टाइड प्रोटीन 10-13 तैयार करने के लिए किया जा सकता है विभिन्न अनुप्रयोगों या पेप्टाइड्स के लिए या तो सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है।
स्पॉट संश्लेषण एक ठोस समर्थन के रूप में एक सेलूलोज़ झिल्ली का उपयोग करता है और मानक Fmoc-रसायन शास्त्र 10-13 कार्यरत हैं, जो ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण, का एक संस्करण है। इसलिए, पेप्टाइड श्रृंखला के संश्लेषण सी टर्मिनल अंत में शुरू होता है और दिशा आयराइबोसोम में जैविक संश्लेषण के विपरीत एन टर्मिनल अंत। सेल्यूलोज झिल्ली पहले सक्रिय अमीनो एसिड (छवि। 1) की कुर्की के लिए क्रियाशील कर रहे हैं। स्पॉट विधि एक स्वचालित pipetting प्रणाली का उपयोग कर झिल्ली पर परिभाषित स्पॉट करने के लिए विलायक की एक छोटी बूंद में सक्रिय अमीनो एसिड के अनुक्रमिक वितरण पर आधारित है। तरल पदार्थ की छोटी बूंद इसे बाद में पेप्टाइड संश्लेषण में रासायनिक प्रतिक्रियाओं के लिए एक खुला रिएक्टर के रूप में कार्य करता है जो एक परिपत्र गीली जगह, रूपों जहां झरझरा झिल्ली पर तिरस्कृत है। स्थान आकार तिरस्कृत मात्रा और झिल्ली के अवशोषण की क्षमता से निर्धारित होता है, इस तरह के धब्बे के गुणकों सरणियों के रूप में व्यवस्थित कर रहे हैं। संश्लेषण के पैमाने स्थान आकार और झिल्ली की लोडिंग क्षमता के साथ संबद्ध करता है। स्पॉट और सरणियों के घनत्व के बीच की दूरी हाजिर आकार बदलती द्वारा प्रबंधित कर रहे हैं। सेल्यूलोज झिल्ली पेप्टाइड संश्लेषण में ठोस चरण के रूप में कई फायदे हैं, यह रासायनिक करने के लिए, सस्ती सहिष्णु हैजलीय समाधान में स्थिर और संभालना आसान पेप्टाइड संश्लेषण में इस्तेमाल ए एल एस। इसके अलावा, अपने हाइड्रोफिलिक प्रकृति कई जैविक परख प्रणालियों के लिए यह उपयुक्त बनाता है। स्पॉट संश्लेषण मैन्युअल रूप से बाहर किया जाता है या पेप्टाइड्स की अपेक्षित संख्या के आधार पर (पेप्टाइड्स के 1000s के लिए) स्वचालित किया जा सकता है। Intavis (कोलन, जर्मनी) से एक पूरी तरह से स्वचालित स्पॉट सिंथेसाइज़र हमारे अनुप्रयोगों के लिए प्रयोग किया जाता है। यह अलग अलग मात्रा में और अलग अलग लंबाई की पेप्टाइड्स के संश्लेषण के लिए परमिट। भी कदम वार संश्लेषण 14,15 द्वारा तैयार किया जा सकता है रैखिक पेप्टाइड्स नियमित रूप से अप करने के लिए 42 एमिनो एसिड के अलावा पेप्टाइड्स में, 15 से 20 एमिनो एसिड की लंबाई के साथ संश्लेषित कर रहे हैं। हालांकि, अमीनो एसिड की संख्या बढ़ती जा रही पेप्टाइड्स की गुणवत्ता को प्रभावित करता है, जो समग्र युग्मन पैदावार में कमी की ओर जाता है। क्योंकि मौके प्रति पेप्टाइड्स की कम मात्रा के कारण, उत्पादों अक्सर शुद्ध करने के लिए मुश्किल हो जाता है और व्यक्ति पेप्टाइड्स की गुणवत्ता आसानी से मूल्यांकन नहीं किया जा सकता। इसलिए, परिणाम स्पॉट pept से प्राप्तआईडीई सरणियों शुद्ध और पेप्टाइड संश्लेषण में या वांछित पेप्टाइड दृश्यों से युक्त प्रोटीन synthesizing द्वारा मानकों के अनुसार विश्लेषण किया जा सकता है, जो बड़े पैमाने में मानक तरीकों, द्वारा संश्लेषित पेप्टाइड्स के साथ या तो पुष्टि की जानी चाहिए। फिर भी, हम अत्यधिक विश्वसनीय होना मौके संश्लेषण पाया और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होने के लिए आम तौर पर यह परिणाम है। स्पॉट संश्लेषण पेप्टाइड्स से पहले और इसके अलावा अंतिम पक्ष श्रृंखला संरक्षण समूह की दरार और, के बाद संशोधित करने की अनुमति देता है, अमीनो एसिड, भी संश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध संशोधित अमीनो एसिड proteinogenic तक ही सीमित नहीं है, यह भी के समावेश की अनुमति देता है , phosphorylated methylated या acetylated अमीनो एसिड 11।
स्पॉट विधि द्वारा संश्लेषित Immobilized पेप्टाइड पुस्तकालयों सीधे कई जैविक और जैव रासायनिक assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हम PKMTs की सब्सट्रेट विशिष्टता की जांच के लिए 300-400 पेप्टाइड्स शामिल पेप्टाइड सरणियों कार्यरत हैं। एंजाइमी modifi के लिएकेशन, पेप्टाइड सरणियों संबंधित PKMT साथ incubated रहे हैं और एक उपयुक्त बफर में [methyl- 3 एच] -AdoMet लेबल। संबंधित सब्सट्रेट के मिथाइलेशन autoradiography के माध्यम से पेप्टाइड सब्सट्रेट करने के लिए AdoMet से radioactively लेबल वाले मिथाइल समूह के enzymatic हस्तांतरण (छवि। 3) का पालन करते हुए विश्लेषण किया है। इस प्रक्रिया के द्वारा, पेप्टाइड सरणियों एक ही समय में अलग पेप्टाइड substrates के मिथाइलेशन के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं। इस विधि से एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि सभी पेप्टाइड्स मेथिलिकरण कैनेटीक्स के रैखिक चरण के दौरान, प्रत्येक पेप्टाइड के रिश्तेदार मेथिलिकरण हदबंदी लगातार (कश्मीर बिल्ली / कश्मीर से विभाजित उत्प्रेरक की दर लगातार करने के लिए आनुपातिक ऐसी है, कि प्रतियोगिता में methylated रहे हैं संबंधित पेप्टाइड सब्सट्रेट के लिए एंजाइम की डी)। इसलिए, प्रत्येक स्थान में शामिल रेडियोधर्मिता की राशि सीधे विशेष पेप्टाइड की ओर enzymatic गतिविधि के साथ जोड़ा जाता है। का प्रयोगएक पेप्टाइड सरणी मेथिलिकरण प्रयोग के परिणाम, PKMT की विशिष्टता प्रोफाइल predicated किया जा सकता है इस उपन्यास substrates पर परिभाषित किया है और आधार पर किया जा सकता है। पेप्टाइड सरणियों पेप्टाइड स्तर पर उपन्यास substrates के मिथाइलेशन के तेजी से और लागत प्रभावी सत्यापन अनुमति देते हैं। इस के लिए, सरणियों लक्ष्य स्थलों पर बजाय लिस के एक आला युक्त संशोधित पेप्टाइड्स के साथ ही सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण पेप्टाइड्स के साथ मिलकर भविष्यवाणी उपन्यास substrates के होते हैं कि तैयार कर रहे हैं। अंत में, उपन्यास substrates के एक साथ म्यूटेंट के साथ प्रोटीन, जिसमें लक्ष्य लिस अला को बदल दिया है और मेथिलिकरण प्रोटीन के स्तर पर इस बात की पुष्टि की जा सकती है के रूप में तैयार किया जा सकता है। परिणामों पर निर्भर करता है, यह तो नव वर्णित प्रोटीन substrates के मिथाइलेशन के संभावित भूमिकाओं को संबोधित जैविक अध्ययन के द्वारा पीछा किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ वर्णित के रूप में स्पॉट संश्लेषण प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत साइटों नक्शा और पेप्टाइड संशोधित एंजाइमों के सब्सट्रेट मान्यता की जांच के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। स्पॉट विधि द्वारा संश्लेषित पेप्ट?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
| N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
| Piperidine ≥ 99 % for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥ 98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Triisopropylsilane 99%, | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
| Dichlormethane ≥99,9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
| N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
| Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
| Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
| MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
| HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix software | TotalLab | n.a. |
Riferimenti
- Margueron, R., Reinberg, D. Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information. Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Helin, K., Dhanak, D. Chromatin proteins and modifications as drug targets. Nature. 502, 480-488 (2013).
- Clarke, S. G. Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box. Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).
- Rathert, P., et al. Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets. Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).
- Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation. Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).
- Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology. Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).
- Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions. Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).
- Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays. Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports–principles and applications. Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).
- Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).
- Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).
- Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method. Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).
- Toepert, F., et al. Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).
- Volkmer, R. Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology. Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).
- Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays. Chemistr., & biology. 15, 5-11 (2008).
- Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues. Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).
- Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase. Chemistr., & Biology. 18, 111-120 (2011).
- Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1. Chemistr., & Biology. 21, 226-237 (2014).
- Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs. Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).
- Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method. Chimica. 6, 3196-3203 (2000).
- Kramer, A., et al. Spot synthesis: observations and optimizations. J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).
- Stadler, V., et al. Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).
- Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays. Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).
- Mah, A. S., et al. Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening. BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).
